随着人们对食品安全问题的关注,生产出一种新型的、天然的防腐剂,来替代化学防腐剂,成为了大家共同的期待。自乳酸链球菌素Nisin作为高效的防腐剂应用于食品以来,细菌素的研究便成为微生物学研究中的一个活跃领域。细菌素是由微生物在代谢过程中,通过核糖体机制产生的一类蛋白或多肽物质,因其具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点,成为生物食品防腐研究的重点,同时被认为是抗生素最有效的替代物。目前国内外关于细菌素的研究,内容主要涉及高产菌株的筛选、产细菌素条件的优化、抑菌物质的分离纯化、结构鉴定和抑菌机理的研究,而关于菌种的来源,主要集中在乳酸菌中,对其他菌种的研究则相对较少。本实验以一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)BD3526为来源,分离抑菌活性物质,拓展了细菌素的来源范围,希望今后有望将类芽孢杆菌属细菌作为研究对象,分离出高效广谱的细菌素,应用于食品和其它行业。在菌株的筛选过程中,通过初筛和复筛,得到一株类芽孢杆菌BD3526,其TYC液体发酵上清,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC1.879,藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CGMCC1.1848,单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)CGMCC1.9136,三株G~+菌有明显的抑制作用。通过比较发酵上清和活体菌体的抑菌活性,发现在发酵过程中,由于受温度、时间、通氧量等影响,发酵上清抑菌活性不稳定,而活体菌体抑菌活性强且重复性好。所以本课题选择BD3526菌体作为抑菌物质的来源,制备粗提物。本课题使用有机溶剂抽提菌体得到抑菌物质粗品,拮抗菌平板4℃放置6 d,用丙酮抽提,得到的抑菌物质活性最高。然后,通过Sephadex LH-20初步纯化丙酮抽提物中的抑菌物质。在纯化前,丙酮抽提物对藤黄微球菌的最低抑菌浓度(MIC)是12.5 mg/m L,对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的MIC值为25 mg/m L;Sephadex LH-20纯化样品对藤黄微球菌的MIC是1 mg/m L,对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的MIC值为2 mg/m L。经过Sephadex LH-20分离,样品的MIC值缩小了12.5倍,这表明样品得到了有效的纯化。最后,通过RP-HPLC进一步纯化样品,以甲醇-水系统洗脱,收集得到活性组分。热稳定性实验中,将样品分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃处理2 h,100℃处理15 min,121℃处理5 min,与对照组相比,处理组样品活性没有明显变化,说明样品热稳定性良好。最适p H范围测定中,将样品分别溶解在不同p H的缓冲溶液中,以p H 7样品做对照,结果表明在酸性环境中,样品的活性受到抑制,在中性偏碱条件下其活性最高。酶敏感性实验中,经胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K处理后,样品的活性不变,而经链霉蛋白酶处理后,其活性基本消失。在0～18 h内,未经酶处理样品抑菌率最高为90.43%,经链霉蛋白酶处理后样品最高抑菌率为17.45%。在抑菌机理的探究实验中,首先,研究了不同浓度样品对藤黄微球菌生长的影响,结果表明样品可以增加藤黄微球菌生长的延迟期,且在低浓度时,作用方式是抑菌,高浓度时,作用方式为杀菌。其次,利用LIVE/DEAD Bac Light染色法测定藤黄微球菌活菌水平,样品处理后活菌水平为54.38%,而对照组活菌水平为98.52%,通过荧光显微镜观察,样品处理后菌体死细胞数量明显增加。最后,检测到经样品处理后细菌胞外核酸和蛋白含量明显增加,这表明样品可能是通过作用于菌体细胞膜,使其形成孔洞,造成细胞内容物外漏,从而起到杀菌作用。