研究背景：2008年Stein等对结肠癌的癌灶、转移灶以及正常结肠组织进行了全基因分析,发现并命名了一个新的癌基因—结肠转移相关基因-1(metastasis associated in colon cancer-1, MACC1)。研究表明MACC1与结肠癌复发、转移和死亡等临床预后指标密切相关。其机制是MACC1通过在转录水平上调控肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,c-Met)的表达,影响肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)/c-Met信号转导通路,促进肿瘤细胞增殖和侵袭。近年又有研究陆续报道了MACC1在肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等多种实体瘤组织中高表达,且与肿瘤细胞增殖、耐药及抗凋亡密切相关。但MACC1在胃癌中的作用却鲜有报道。为进一步明确MACC1在促进胃癌恶性化进程中的作用,我们构建了MACC1过表达和MACC1沉默的胃癌稳转细胞株,并进行基因芯片分析。通过一系列前期临床数据研究,我们已经证实MACC1对胃癌的发生发展起到广泛而重要的作用。然而,目前尚不清楚是何种机制引起MACC1的激活,且MACC1更多的生物学功能也有待进一步挖掘。恶性肿瘤是一种代谢消耗性疾病,与正常组织相比,肿瘤倾向于采用一种独特的代谢过程,称为“有氧糖酵解”。即使在有足够氧气的情况下肿瘤代谢葡萄糖倾向于产生大量乳酸,而不是二氧化碳和水。肿瘤细胞的代谢异常被认为是癌症的标志之一。同时,紊乱的代谢环境又能加快肿瘤的发生和发展,与肿瘤之间形成恶性循环,互为因果。肿瘤细胞对葡萄糖的依赖不仅由于能量供给的需要,还源于生物合成的需要。当葡萄糖缺乏时,或消耗葡萄糖的能力受到干扰时,肿瘤细胞需要承受代谢应激(metabolic stress)。代谢应激是生物体在物质能源消耗大于补充时的一种应激反应,代谢应激会进一步触发一系列的下游效应,包括氧化应激、细胞毒性和炎症反应等,并引起细胞凋亡。然而,肿瘤细胞往往能抵御代谢应激,并抵抗凋亡。其中,一些癌基因扮演着重要的作用。这些癌基因能抵御代谢应激所带来的伤害并促发侵袭、抗凋亡与新生血管形成,而这被认为是肿瘤抵御“饥荒”的自我调节。代谢应激、葡萄糖剥夺刺激、缺氧、缺血引起的能源不足均可激活磷酸化腺苷活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK),使p-AMPK活化。AMPK是一种广泛存在能量感受分子,当腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)供应受阻时,胞内5’-腺嘌呤核苷酸(adenosine monophosphate, AMP)的比例增加,AMPK发生磷酸化。AMPK的激活既能引起凋亡,也能代偿性的调控下游一系列的代谢相关基因,以维持细胞代谢的稳定性。尽管MACC1和代谢应激及AMPK的关系尚不清楚。但已有文献报道,MACC1能通过激活磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threorine kinase, AKT)信号调节通路促进肿瘤细胞生长增殖与转移。而AKT已经被证明在肿瘤细胞中与葡萄糖转运和糖酵解上调有关,激活的AKT能使肿瘤细胞对葡萄糖摄取增加；此外,在慢性糖缺乏时,AKT磷酸化增加并且AKT通路高度激活；激活AKT生存途径还可以减少肿瘤细胞凋亡。因此我们推测"MACC1与代谢应激”二者间存在一定的内在联系,代谢应激可能通过激活MACC1启动其下游复杂的分子信号网路以“抵御”代谢应激所带来的“生存危机”。研究假设：1.葡萄糖缺乏引起的代谢应激可通过上调AMPK信号通路激活MACC1,使MACC1表达水平升高,并发生核转位。2. MACC1高表达的肿瘤细胞能通过保护线粒体、减少活性氧生成等途径,抵抗代谢应激,进而使肿瘤细胞存活。研究方法：1.PCR法检测胃癌组织及癌旁组织MACC1基因表达情况收集2013年2月至2013年8月于南方医院普外科行胃癌根治性切除手术的患者共20例,所有患者均经病理诊断为胃癌。采集20例胃癌患者的新鲜胃癌样本,以PCR方法检测胃癌组织和癌旁非肿瘤组织中MACC1mRNA的表达水平。2.葡萄糖剥夺刺激后MACC1、p-AMPK基因和(或)蛋白的表达选取低分化的BGC-823和高分化的MKN-28胃癌细胞株作为代表,构建细胞模型。运用PCR与Western-blot检测方法,以“葡萄糖剥夺”引发代谢应激,对胃癌细胞进行刺激,检测MACC1与p-AMPK在基因及蛋白水平的变化；以及胃癌细胞细胞核与细胞浆中MACC1蛋白表达水平的变化,分析“代谢应激一AMPK-MACC1"之间的关系。3.AMPK促进剂刺激后MACC1基因、蛋白的表达选取低分化的BGC-823和高分化的MKN-28胃癌细胞株作为代表,构建细胞模型。运用PCR与Western-blot检测方法,以AMPK激动剂(二甲双胍与AMP)给予刺激,分析MACC1基因与蛋白表达水平变化；以及二甲双胍刺激后胃癌细胞细胞核与细胞浆中MACC1蛋白表达水平的变化,进一步明确代谢应激能否通过激活AMPK通路调控MACC1表达,并促进MACC1发生核转位。4.葡萄糖剥夺刺激后细胞存活率、细胞凋亡率与细胞活力的检测选取MACC1正常表达(scramble)与MACC1沉默(sh MACC1)的胃癌细胞株BGC-823与MKN-28作为代表,构建细胞模型。采用MTT.Annexia V-PI双染法、TUNEL染色、透射电子显微镜等检测方法,以“葡萄糖剥夺”引发代谢应激,对胃癌细胞给予刺激,分析MACC1正常表达与MACC1沉默的胃癌细胞在细胞存活率、细胞凋亡率、细胞活力及细胞亚显微结构改变(线粒体,内质网等)方面的差异,以明确MACC1能否抵抗“葡萄糖剥夺”引起的代谢应激。5.葡萄糖剥夺刺激后细胞内活性氧、细胞线粒体膜电位检测选取MACC1正常表达(scramble)与MACC1沉默(sh MACC1)的胃癌细胞株BGC-823与MKN-28作为代表,构建细胞模型。采用活性氧、线粒体膜电位等方法检测在无糖刺激下MACC1基因正常表达组与沉默组在细胞内活性氧水平,细胞内线粒体膜电位改变方面是否存在差异,进一步证明MACC1可通过抑制活性氧及稳定线粒体膜电位等机制抵抗代谢应激。6.糖酵解抑制剂刺激后,细胞存活率检测选取MACC1正常表达(scramble)与MACC1沉默(sh MACC1)的胃癌细胞株BGC-823与MKN-28作为代表,构建细胞模型。运用MTT检测方法,在MACC1正常表达的胃癌细胞中给予2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-arabino-hexose,2-DG)、3-溴丙酮酸乙酯(3-bromo-2-oxo-propanoicaciethylester,3-BP)、二氯乙酸钠(sodium dichloroacetate, DCA)、草酰酸钠(Ethyl oxamate,OXA)等糖酵解抑制剂刺激,分析在葡萄糖剥夺刺激后不同时间点MACC1正常表达组、MACC1正常表达+糖酵解抑制剂组(2-DG、3-BP、DCA、OXA)、MACC1沉默组胃癌细胞存活率的差异。进一步明确阻断糖酵解后能否影响MACC1对代谢应激的抵抗现象。7.统计学方法所有结果都应用SPSS19.0软件进行统计学处理。所有实验重复至少3次,并计算平均值。数据报告为平均值±SEM。差异的显著性均是通过单因素方差分析或Student’s-T检验分析。所有P值<0.05被认为有统计学意义。研究结果1. MACC1在胃癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况以PCR方法检测胃癌样品和癌旁非肿瘤组织中MACC1mRNA表达水平,在所检测的20例胃癌患者的新鲜胃癌样本中,其胃癌组织中MACC1mRNA的表达水平高于癌旁非肿瘤组织,且具有显著统计学差异(p<0.001)。2.代谢应激激活MACC1与对照组相比较,葡萄糖剥夺刺激后MACC1的mRNA表达及蛋白表达水平均显著升高,且细胞核中MACC1蛋白表达增多,细胞浆中MACC1减少(p<0.05),提示代谢应激可激活MACC1并促进MACC1发生核转位。3.代谢应激通过调控AMPK激活MACC1与对照组相比,葡萄糖剥夺刺激后p-AMPK蛋白水平升高；给予AMPK激动剂后,MACC1蛋白、mRNA表达水平随AMPK表达变化,即p-AMPK表达增高时MACC1表达增高,p-AMPK表达减低时结果则与之相反,与对照组相比较具有统计学差异(p<0.05)。关于MACC1在细胞中的分布,我们发现葡萄糖剥夺刺激,及二甲双胍、AMP模拟的代谢应激刺激,不仅能使MACC1总蛋白表达增加,还能使细胞核中的MACC1增高,而细胞浆中MACC1蛋白表达水平减少(p<0.05),进一步提示代谢应激是通过上调AMPK激活MACC1表达,并促进MACC1发生核转位。4.MACC1激活抗凋亡机制抵抗代谢应激运用MTT、Annexia V-PI双染法、TUNEL染色法检测细胞凋亡率及细胞存活率,与对照组(scramble)相比,葡萄糖剥夺刺激后,MACC1沉默的胃癌细胞株(sh MACC1)其各时间点细胞存活率均显著下降,且均存在统计学差异(p<0.05),明确了MACC1可激活抗凋亡机制抵抗“葡萄糖剥夺”引起的代谢应激。5.MACC1保护线粒体抵抗代谢应激与对照组(scramble)相比,葡萄糖剥夺刺激后,细胞透射电镜下观察可见,MACC1沉默组(shMACC1)其细胞凋亡与坏死增加,细胞亚显微结构毁损更严重,细胞线粒体肿胀、线粒体嵴消失、内质网结构模糊、细胞内大量空泡形成。与对照组(scramble)相比,葡萄糖剥夺刺激后,MACC1沉默的胃癌细胞株(sh MACC1)其线粒体膜电位下降,各时间点细胞内活性氧水平升高,且均存在统计学差异(p至少小于0.05),进一步明确了MACC1可激活线粒体保护等抗凋亡机制抵抗“葡萄糖剥夺”引起的代谢应激。6.糖酵解阻断后MACC1抵抗代谢应激能力下降MACC1正常表达组(scramble)、MACC1正常表达组+糖酵解抑制剂组(2-DG、3-BP、DCA、OXA)、MACC1沉默组(shMACC1)胃癌细胞给予葡萄糖剥夺刺激后,MTT法检测显示,与MACC1正常表达组(scramble)相比较,糖酵解抑制剂组及MACC1沉默组,其各时间点细胞存活率均降低,均有统计学差异(p至少小于0.05)。研究结论1.MACC1在胃癌组织中高表达,提示MACC1在胃癌发生、发展中的占有一定作用,值得进一步探讨。2.葡萄糖缺乏引起代谢应激可通过激活AMPK上调MACC1,并促进MACC1表达增高、发生核转位。3.MACC1能通过稳定线粒体膜电位、减少活性氧生成等线粒体保护机制,抵抗代谢应激所引起的细胞损伤与凋亡。4.阻断糖酵解或抑制MACC1均能使胃癌细胞对代谢应激的抵抗能力下降,提示抑制MACC1可能成为肿瘤抗代谢治疗的新靶点。