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背景:CAR-T细胞治疗肿瘤研究是近年来恶性肿瘤治疗领域研究热点之一。目前构建的大多数CAR-T细胞是靶向肿瘤细胞外抗原产生抗肿瘤效应。然而肿瘤细胞外抗原数量有限,大多数的肿瘤抗原是肿瘤细胞内抗原。研发TCR样抗体CAR-T细胞靶向肿瘤细胞内抗原进行抗肿瘤作用具有重要意义。传统的CAR-T细胞采用的胞外段抗原结合区均为单链抗体。单链抗体是由抗体重链可变区、铰链区和轻链可变区连接而成。由于重链可变区和轻链可变区容易产生错配以及铰链区优化工艺的复杂性使得传统CAR-T的活性和应用受限。纳米抗体能够克服传统单链抗体的缺点,因此探索构建基于TCR样纳米抗体CAR-T细胞抗肿瘤效应将对CAR-T细胞治疗研究领域产生新的突破。目的:利用前期已筛选出的靶向WT1肽抗原复合物的纳米抗体,制备基于纳米抗体的WT1 Nb-CART细胞(WT1 Nb-CAR),并采用体内外实验验证其抗肿瘤效应,将为TCR样抗体CAR-T细胞抗肿瘤研究提供新的技术手段和新思路。方法:1.分离培养人外周血T淋巴细胞,通过慢病毒转染完成WT1 Nb-CAR T细胞的构建;构建完成后,在荧光显微镜下观察WT1 Nb-CART细胞的GFP表达情况;用流式细胞仪检测WT1 Nb-CART细胞表面GFP表达的比例。2.利用细胞增殖实验检测Utd组、Mock组、GPC3 Nb-CAR组和WT1 Nb-CAR组的T淋巴细胞分别与OVCAR3细胞共孵育后的增殖情况。3.利用细胞毒杀伤方法检测Utd组、Mock组、GPC3 Nb-CAR组和WT1:Nb-CAR组的T淋巴细胞分别与OVCAR3细胞、Nam16细胞、K562细胞、MCF7细胞、空载的T2细胞以及加载各个肽段的T2细胞共孵育后对靶细胞的杀伤情况;4.利用ELISA方法检测Utd组、Mock组、GPC3 Nb-CAR组和WT1 Nb-CAR组的T淋巴细胞分别与OVCAR3细胞共孵育后的上清液中细胞因子(IFN-γ、TNF-α IL-12、IL-10)的含量。5.利用流式细胞仪分析方法检测Utd组、Mock组、GPC3 Nb-CAR组和WT1 Nb-CAR组的T细胞分别与OVCAR3细胞共孵育后的效应细胞表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L,溶酶体蛋白CD107a的表达。6.构建OVCAR3细胞小鼠皮下移植瘤模型,随机分为PBS、Utd、Mock、GPC3 Nb-CAR和WT1 Nb-CAR组。经尾静脉分别注射各组CAR-T细胞和未转染T细胞后,观察WT1 Nb-CART细胞对小鼠肿瘤的肿瘤体积、肿瘤重量以及小鼠存活时间的影响。结果:1.将慢病毒转染T细胞后,荧光显微镜下可观察到GFP荧光,流式细胞仪检测结果显示WT1 Nb-CART细胞的GFP表达量为(34±1.54)%,表明WT1 Nb-CAR T细胞制备成功。2.增殖实验结果显示WT1 Nb-CART细胞在经过HLA-A2+WT1+靶细胞(OVCAR3细胞)刺激后增殖高于其余对照组。3.细胞毒杀伤实验结果显示WT1 Nb-CAR细胞对HLA-A2+WT1+靶细胞(OVCAR3细胞)的杀伤效率高于其它对照组。4.WT1 Nb-CAR T细胞和HLA-A2+WT1+靶细胞(OVCAR3细胞)共孵育后细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)的分泌高于其他对照组,IL-10的分泌各组间无明显差异。5.WT1 Nb-CAR细胞经HLA-A2+WT1+靶细胞(OVCAR3细胞)刺激后表面活化分子(CD25、CD69)、记忆分子(CD62L)及溶酶体蛋白CD107a的表达量较其余对照组升高。6.体内实验观察到WT1 Nb-CAR治疗可抑制荷OVCAR3瘤小鼠的肿瘤生长,延长小鼠的生存时间。结论:本研究成功构建了基于纳米抗体的WT1 Nb-CART细胞,所构建的WT1 Nb-CART细胞在体外可以特异性靶向杀伤HLA-A2+WT1+靶细胞,在体内具有良好的抗肿瘤效果,为TCR样抗体CAR-T细胞抗肿瘤研究提供了新的技术手段和新的研究方向。