【摘 要】
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抑肽酶是一种天然非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂,用途较为广泛,其作为一种重要的生化药物在外科手术中的止血作用尤为突出.目前,抑肽酶制品主要从牛肺或牛胰中提取,因此重组抑
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抑肽酶是一种天然非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂,用途较为广泛,其作为一种重要的生化药物在外科手术中的止血作用尤为突出.目前,抑肽酶制品主要从牛肺或牛胰中提取,因此重组抑肽酶的开发和研制有着很好的前景.该课题的主要任务是研究用基因工程的方法较大规模制备重组抑肽酶的可行性.采用分子克隆技术,扩增出抑肽酶的结构基因,同时在抑肽酶基因上游引入因子Xa的识别位点,将此基因导入融合表达载体pGrxA,再将重组质粒转化至大肠杆菌Origami中,从而成功构建融合表达抑肽酶的工程菌.培养工程菌时用异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)或乳糖诱导表达目的蛋白,收集菌体并超声破壁细胞后,经SDS-PAGE电泳检测,电泳结果显示目的蛋白多以可溶性形式存在于胞内.菌体超声破壁后离心,上清液经生物凝胶层析柱Bio-gel P10和离子交换层析柱CM-Sepharose Fast Flow后,可收集到硫氧还原蛋白—抑肽酶融合蛋白,该融合蛋白经因子Xa切割后,可得到N端不含多余氨基酸残基且与天然构像一致的活性重组抑肽酶.对抑肽酶的制备工艺初步研究后发现,可通过优化制备工艺等措施来降低成本,最终实现工业化大规模制备重组抑肽酶.
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