研究背景和目的： 女性的生殖能力在25岁左右达到高峰，35岁以后生殖能力明显降低。在辅助生殖技术工作中，37岁以上患者的妊娠率仅在20％左右，多项研究提示与年龄有关的妊娠率降低以及因胚胎质量差反复种植失败是由于卵子线粒体功能障碍，产生ATP的能力降低，不能维持正常的染色体分离、生物合成、有丝分裂及胚胎细胞的各种生理功能；由此导致种植期胚胎细胞的发育异常或终止。本研究分四个部分。首先应用免疫组织化学的方法检测PGC-1在生殖力旺盛和衰退的大鼠卵巢内的表达，探讨线粒体的增殖变化；其次用纺锤体成像系统观察人类不同生殖年龄阶段的卵子纺锤体，探讨线粒体功能变化；再次用透射电子显微镜观察卵丘复合体的颗粒细胞的超微结构变化，探讨自体颗粒细胞线粒体移植的可行性；最后采用辅助生殖技术中生育年龄较大和反复失败患者自身的颗粒细胞线粒体，进行卵细胞内移植，以改善胚胎发育质量，提高妊娠率。 第一部分 PGC-1在大鼠卵巢内的表达 材料与方法：取2月龄和1年2月龄大鼠的卵巢做冰冻切片，用羊PGC-1抗体和ABC试剂盒做免疫组织化学染色，检测PGC-1在年老和年幼大鼠卵巢内的表达情况以及差异。 结果：切片可见卵巢组织的皮质和髓质以及部分输卵管；卵巢组织内可见原始卵泡和各期发育中的卵泡。发育期的卵泡内可见卵丘复合体，卵子呈现棕黄色，颗粒细胞层无着色，但周围的卵泡膜细胞可见轻度着色。髓质内平滑肌和血管平滑肌细胞着色深。输卵管平滑肌以及纤毛柱状上皮呈强的棕黄色。年老的大鼠和年幼的大鼠的卵巢组织相比，皮质减少，髓质增多，原始卵泡以及发育卵泡的数量减少。各种组织细胞的染色情况没有可见差异。第二部分人卵子纺锤体与卵子和胚胎发育质量 材料与方法:从2003年8月至2004年4月间来南方医院生殖医学中心行ICSI治疗的31名女性患者;分为年轻组和大龄组，年轻组14名，年龄在24~30岁，平均年龄27士2.3岁;大龄组17名，年龄在37~42岁，平均年龄38士2.1岁。患者全部采用G刘RHa长周期降调节方案。在做ICSI之前首先用纺锤体成像系统观察成熟的Mn期卵子有无出现纺锤体，并比较两组中纺锤体的出现率、受精率和良好胚胎形成率。 结果:年轻组有169个成熟卵子，其中126(74.6%)个卵子可观察到纺锤体;大龄组有119个卵子，其中62(52.1%)个卵子可观察到纺锤体。年轻组和大龄组相比，两组间的纺锤体出现率有显著差异，尸<0.01。两组间的卵子受精率分别是80.5%和75.6%，没有显著差异;两组间的良好胚胎形成率分别为57.6%和39.1%，差异显著，尸<0.01。年轻组和大龄组内观察到纺锤体的卵子的良好胚胎形成率为64.6%:48.9%，没有统计学差异，尸>0.05;年轻组和大龄组内未观察到纺锤体的卵子的良好胚胎形成率为38.2%和28.6%，亦没有统计学差异，尸>0.05。第三部分人黄素化卵丘颗粒细胞的超微结构观察 材料与方法:收集在南方医院生殖中心行ICSI的患者卵子周围的卵丘复合体细胞，用透射电镜观察颗粒细胞的超微结构。 结果:电镜切片下卵丘复合体内的颗粒细胞有3种形态:呈正常形态的，细胞膜完整，细胞质内可见正常形态线粒体、溶酶体、脂滴，细胞核形态正常，染色质分布规则。坏死型:颗粒细胞膜不完整，线粒体增大如空泡状，细胞核内染色质呈块状。固缩型:细胞质少，核凝固，结构不清。第四部分人自体颗粒细胞线粒体移植改善卵子质量和胚胎发育的研究 材料与方法:选择2002年7月至2004年4月间在本生殖中心进行体外受精治疗的35例患者;其中因胚胎发育质量差进行了3次以上的胚胎移植没有妊娠的患者16例;女性患者年龄大于37岁的19例。经超促排卵治疗，成熟卵子少于4个的只做线粒体移植;多于4个的随机分为两组，一组做线粒体移植，另一组做ICsl。卵丘复合体经SOu的透明质酸酶消化后，收集卵子周围的颗粒细胞。卵丘颗粒细胞数量不足时收集卵泡液内的颗粒细胞。记数并调整浓度为l护加1。取Inil用冰浴后的细胞匀浆器将颗粒细胞匀浆4一6次，在4℃的冷冻离心机20009离心20分钟;取上2/3的上清液100009离心20分钟。沉淀的线粒体用0.5协1平衡后的mHTF混悬。将制动的精子吸入显微注射针，并移入线粒体微滴吸入约1一1，5个卵子直径长度的液体。然后将线粒体与精子一同注入卵细胞浆内。之后观察卵子的受精和胚胎发育情况。 结果:对于年龄大于37岁的患者，线粒体移植组的受精率是72.5%，ICSJ组74.3%，两组相比无统计学差异(P>0.05);线粒体移植组的良好胚胎形成率是56.4%比ICsl组的35.3%高，并有显著差异(P<0 .05)。14例患者仅移植经线粒体移植后的胚胎，有5例妊娠。对与反复失败的患者，线粒体移植组和ICSI组的受精率分别是75.2%和78.4%，两组间无显著差异(P>0.05);线粒体移植组和ICSI组的良好胚胎形成率分别是59.5%和28.8%，两组比较有显著差异(P<0 .01)。13例患者仅移植经线粒体移植后的胚胎，5例获临床妊娠。小结 1.PGC一1在大鼠卵巢内有表达;生殖力旺盛和生殖力衰退的大鼠卵巢内表达没有变化，提示卵巢组织细胞内线粒体的增殖能力没有降低。 2.年轻患者的卵子?