肥胖日益成为威胁人类健康的公共卫生问题,暂无理想的解决方案。棕色脂肪可以增加能量消耗、改善胰岛素抵抗,且近年来发现成人体内存在棕色脂肪,因此成为治疗肥胖及其相关代谢疾病的研究热点。这些年来人们对于棕色脂肪的定义、生理特点、组胚来源、激活及诱导分化的方式、对于能量和糖脂代谢的影响,及与其相关的分子机制、信号通路都有了越来越深入的研究,亦不断有新的认识取代过去的误解,然而尚未找到理想的药物可以在人体中促进脂肪棕色化。肝X受体(LXRs)与胆固醇、糖脂代谢关系密切,且有多个研究发现LXRs敲除与棕色脂肪的激活有关,但结论尚有争议,具体机制也尚待进一步研究。22-S-羟基胆固醇(22-S-hydroxycholesterol,22-S-HC),作为LXRs的抑制剂,目前发现它可以抑制脂肪合成、增加葡萄糖摄取,但它与脂肪棕色化之间的关系目前尚无研究。对于LXRs抑制在脂肪棕色化的作用这方面进行研究,有助于进一步了解核受体LXRs及其抑制剂22-S-HC在糖脂代谢方面的作用,及其作为肥胖、糖尿病防治的新靶点和新型药物的前景。本研究建立了MEF细胞的棕色脂肪诱导模型,在此基础上,分析研究了LXRs抑制剂22-S-HC对于MEF细胞向棕色脂肪细胞诱导分化的影响,结果发现22-S-HC可以促进MEF细胞表达棕色脂肪细胞的特征。进一步使用22-S-HC进行体内研究,同样发现它能够加强棕色脂肪功能并促使腹股沟白色脂肪棕色化,同时改善机体的糖脂代谢。对LXRs敲低的稳筛MEF细胞进行棕色化诱导,发现LXRs敲低具有和22-S-HC相似的促进棕色化的作用。在探索LXRs影响脂肪棕色化的分子机制的研究中,我们发现22-S-HC和LXRs敲低都可以激活UCP1、PPARγ、PGC1α的启动子活性。通过上述研究,我们揭示了22-S-HC对于肥胖、2型糖尿病的潜在治疗价值以及部分分子机制。本研究分为两个部分：第一部分：肝X受体抑制剂22-S-HC对于脂肪棕色化以及代谢的影响；第二部分：肝X受体抑制对于脂肪棕色化作用的分子机制研究。目的：肝x受体是重要的代谢性核受体,近年来的研究发现肝X受体敲除可以促使脂肪棕色化,增加其特异性的功能蛋白-解偶联蛋白1 (uncoupling protein-1, UCP1)的表达。在这部分研究中,我们旨在体外和体内实验明确肝X受体抑制剂22-S-HC是否对于脂肪棕色化有促进作用。方法：首先,将MEF细胞经棕色脂肪诱导方案诱导分化出棕色脂肪细胞的特征。建立了MEF细胞的棕色脂肪诱导模型后,将22-S-HC加入棕色诱导方案当中,观察22-S-HC是否对于脂肪棕色化有促进作用。利用MTS明确22-S-HC对于MEF细胞的的安全浓度范围,经过油红染色、线粒体-UCP1免疫荧光染色、Western blot和Real-time RT-PCR,对22-S-HC进行浓度梯度和时间梯度的筛选,并观察22-S-HC对于棕色化相关基因、糖脂代谢相关基因表达的作用,以及对于糖脂代谢的影响。其次,建立饮食致肥胖小鼠模型,给予小鼠腹腔注射22-S-HC,观察小鼠的体重变化；在22-S-HC干预前后进行IPGTT和ITT,观察糖代谢、胰岛素抵抗是否改善；通过HE染色观察脂肪组织的变化；通过Western blot和Real-time RT-PCR观察UCP1和糖脂代谢相关基因的变化。结果：1)确立了MEF细胞向棕色脂肪细胞分化的诱导方案,通过Western blot和线粒体-UCP1的免疫荧光染色明确了棕色脂肪诱导方案下的UCP1表达更明显。2)明确了22-S-HC对于MEF细胞的安全浓度范围在10μM以内,22-S-HC浓度在0.5、1μM的条件下,促进MEF细胞的棕色诱导分化效果较好,Western blot以及Real-time RT-PCR提示UCP1表达显著增加(P<0.05),线粒体-UCP1的免疫荧光染色更明显；在诱导分化过程中,UCP1等棕色脂肪相关基因的表达自第4天开始逐渐升高,基本在第14天时达到高峰。3) Western blot以及Real-time RT-PCR提示22-S-HC可以促使棕色化相关基因UCP1和PGCla的表达水平升高(P<0.05); Real-time RT-PCR测得与糖脂代谢相关基因AP2、PPARγ、Adiponectin表达均显著增加,SREBPlc显著减少,以上差异均有统计学意义(P<0.05); 2NBDG摄取实验提示22-S-HC可以提高已向棕色脂肪分化的MEF细胞摄取葡萄糖的能力(P<0.05)。4)在高脂喂养致肥胖小鼠模型中,22-S-HC腹腔注射组小鼠相比对照组小鼠的体重无明显改变；IPGTT及ITT曲线下面积显著减小(P<0.05)；棕色脂肪组织的脂滴减少,腹股沟脂肪组织的脂滴变小；棕色脂肪组织与腹股沟脂肪组织UCP1表达显著增加(P<0.05); 22-S-HC对于不同脂肪组织的AP2、PPARγ、 SREBP1c和Adiponectin表达有不同的影响。结论：MEF细胞在棕色脂肪诱导方案下可以分化出棕色脂肪细胞的特征；22-S-HC在细胞实验和动物实验中都可以促使脂肪棕色化,加强UCP1的表达；22-S-HC可以改善葡萄糖脂肪代谢；22-S-HC对于糖脂代谢中的一些重要基因亦有影响；22-S-HC的作用具有组织特异性。目的：检测敲低LXRs对于脂肪棕色化的作用与第一部分LXRs抑制剂22-S-HC的作用是否一致,明确22-S-HC与LXRs敲低对于UCP1、PPARγ、PGC1α、COX2的启动子活性是否有影响。方法：通过公司设计和合成LXRs shRNA序列,制备含有上述序列的逆转录病毒,应用逆转录病毒感染MEF细胞,检测感染的效果；通过抗生素筛选建立稳转细胞系；将LXRs敲低的MEF细胞进行棕色化诱导,观察敲低组与对照组棕色化细胞特征的区别；构建UCP1、PPARγ、PGC1α、COX2的启动子报告基因质粒,利用双荧光素酶报告检测系统来检测22-S-HC和LXRs敲低对于上述启动子的作用。结果：1)成功地构建了含有LXRs-shRNA序列的逆转录病毒,并筛选出效果最好的LXRα-shRNA3;成功地建立了稳转细胞系。2)将稳定敲低LXRα的MEF细胞进行棕色化诱导后,油红染色发现脂滴无明显变化,Western blot和Real-time RT-PCR结果均显示UCP1、PPARγ、PGC1α的表达水平升高(P<0.05)；稳转敲低细胞系的葡萄糖摄取能力较对照组增加(P<0.05)。3)成功地构建了UCP1、PPARγ、PGC1α、COX2的启动子报告基因质粒,利用双荧光素酶报告检测系统来检测22-S-HC和LXRs敲低对于上述启动子的作用,发现22-S-HC和LXRs的敲低对于UCP1、PPARγ、PGC1α启动子几乎都有较高的激活(P<0.05),提示LXRs抑制可以对上述启动子起增强作用,从而增加相应基因的表达,促进脂肪棕色化。结论：LXRα敲低具有和22-S-HC相似的促进脂肪棕色化的影响；22-S-HC和LXRα敲低都可以激活脂肪棕色化过程中的关键基因UCP1、PPARγ、PGC1α的启动子活性。