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背景和目的细菌性脑膜炎是一种较为严重的中枢系统感染性疾病,在婴幼儿中较为多见,其致死率和致残率较高。其发病机制主要是炎症反应所致血脑屏障通透性改变。由于婴幼儿抵抗力较弱,血脑屏障发育不完善,细菌易进入中枢神经系统,对其生命产生威胁和造成严重的后遗症。有75%以上细菌性脑膜炎发生在<5岁的儿童,据WHO估计全球每年死于细菌性脑膜炎儿童约有17万人。因此探讨细菌性脑膜炎的病理机制,寻找新的途径治疗细菌性脑膜炎对患者有着重大的意义。缝隙连接是相邻两个细胞间形成的跨膜通道,其构成的细胞缝隙连接通讯能够调节细胞间物质和信号的交换,是细胞间直接交换物质进行信息通讯的唯一通道,是影响血脑屏障通透性的重要因素,在细胞的生长发育、分化、免疫应答等各种生理过程发挥了至关重要的作用。目前在哺乳动物体内发现有20多种连接蛋白,其中缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)在星形胶质细胞分布最为丰富广泛。研究发现Cx43表达异常和皮肤烧伤、心血管疾病、肿瘤、生殖系统疾病等多种病理生理异常相关。癫痫、脑肿瘤、脑损伤、抑郁症、脑胶质瘤等神经系统疾病中也发现Cx43表达异常。有研究发现星形胶质细胞介导的炎症反应中Cx43表达异常,因此我们推测Cx43在细菌性脑膜中发挥重要作用。microRNA(miRNA)是一种真核细胞中广泛存在的非编码的内源性小RNA分子,其能够与靶基因3’UTR区碱基互补配对从而参与基因转录后调控,在生命过程中一系列重要进程中发挥了重要作用,据发现有可能超过30%的蛋白质受到miRNA的调控。我们采用生物信息学分析Cx43可能是miR-301a-3p靶基因。因此本研究我们将检测miR-301a-3p和Cx43在大鼠细菌性脑膜炎模型中表达情况,并分析miR-301a-3p对Cx43的调控作用。探讨细菌性脑膜炎的致病机理,为治疗细菌性脑膜炎寻找新的靶点。本论文包含以下四部分:第一部分:miR-301a-3p、Cx43在大鼠细菌性脑膜炎模型中的表达;第二部分:miR-301a-3p对星形胶质细胞生物学作用的影响;第三部分:miR-301a-3p对Cx43转录后调控作用机制的初步研究;第四部分:miR-301a-3p对细菌性脑膜炎大鼠的影响。第一部分miR-301a-3p、Cx43在大鼠细菌性脑膜炎模型中的表达方法:1.制备细菌性脑膜炎大鼠模型,并随机分为模型组(60只)和对照组(20只)。模型组依据处死的时间不同分为三个小组,分别为造模后24h组,造模后48h组,造模后5d组。取脑脊液进行脑脊液白细胞总数计数,比较各组大鼠处死前的死亡率并进行Loeffler神经行为评分。2.ELISA试剂盒检测脑组织中IL-6、IL-8,TNF-α。3.免疫组织化学和western blot检测各组Cx43蛋白表达,qRT-PCR检测Cx43相对表达量。4.qRT-PCR检测miR-301a-3p表达。分析miR-301a-3p和Cx43表达的相关性。5.应用SPSS21.0统计学软件进行统计分析,检验水准а=0.05结果:1.Loeffler评分显示在同一时间点模型组较对照组显著降低(P<0.05),随着时间的增加,模型组大鼠的临床评分逐渐降低(P<0.05)。2.ELISA显示与对照组相比,模型组大鼠脑组织中IL-6、IL-8和TNF-α的表达在24h、48h、5d三个时间点均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),并且随着时间的推移,IL-6、IL-8和TNF-α的表达有逐渐升高的趋势。3.免疫组织化学染色显示对照组Cx43蛋白呈现弱阳性,造模组阳性细胞增加;Western blot检测显示造模组脑组织Cx43蛋白高于对照组(P<0.05),24h表达最高,随着时间的推移Cx43表达逐渐减低。4.qRT-PCR显示造模组miR-301a-3p含量高于对照组(P<0.05),并且随着时间的推移,miR-301a-3p的含量逐渐升高,造模组不同时间段差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分miR-301a-3p对星形胶质细胞生物学作用的影响方法:1.合成miR-301a-3p agomir、miR-301a-3p antagomir,转染星形胶质细胞。2.CCK8检测各组细胞增殖能力。AnncxinV-FITC/PI双标记流式细胞术、Caspase-3检测各组细胞凋亡情况。3.Western blot检测各组细胞中Cx43蛋白表达情况。结果:1.与对照组(Blank组和miR-NC组)相比,miR-301a-3p组细胞的增殖能力显著升高(P<0.05),而miR-301a-3p antagomir转染后细胞的增殖能力显著降低,与对照组(Blank组和miR-NC组)相比有显著性差异(P<0.05).2.将miR-301a-3p agomir转染到星形胶质细胞后,细胞的凋亡率较对照组显著降低(P<0.05);而miR-301a-3p antagomir转染后凋亡细胞的数量明显增加。3.将miR-301a-3p agomir转染到星形胶质细胞后,Western blot检测显示Cx43蛋白表达显著降低(P<0.05)第三部分miR-301a-3p对Cx43转录后调控作用机制的初步研究方法:1.通过生物信息学分析推测miR-301a-3p的候选靶基因。2.构建重组载体wt-pEZX-MT05-Cx43、mut-pEZX-MT05-Cx43。采用双报告载体实验验证miR-301a-3p的靶基因。3.构建表达载体pcDNA3.1-Cx43,通过回复实验分析miR-301a-3p对星形胶质细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.生物信息学分析表明Cx43是miR-301a-3p的靶基因。2.双报告载体实验结果表明miR-301a-3p能够与Cx43 3’UTR区结合,对其表达产生负调控。3.将不含Cx43 3’UTR区的重组载体pcDNA3.1-Cx43转染星形胶质细胞后,能够回复miR-301a-3p对Cx43蛋白表达的负调控作用,引起星形胶质细胞凋亡。第四部分miR-301a-3p对细菌性脑膜炎大鼠的影响方法:1.SD大鼠20只,制备细菌性脑膜炎动物模型,并随机分为模型组(10只)和miRNA处理组(10只),miRNA处理组予以miR-301a-3p agomir治疗。同时选用10只正常大鼠作为对照。2.比较各组大鼠Loeffler神经行为评分。ELISA试剂盒检测各组IL-6、IL-8,TNF-α的表达。Western-blot检测Cx43蛋白的表达。结果:1.模型组和miRNA组Loeffler评分均低于对照组,而miRNA组Loeffler评分高于模型组,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。2.ELISA检测显示模型组和miRNA组IL-6、IL-8,TNF-α浓度较对照组显著升高,而miRNA组IL-6、IL-8,TNF-α浓度低于模型组,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。3.Western blot检测模型组和miRNA组Cx43蛋白表达量较对照组显著升高,而miRNA组Cx43蛋白表达量低于模型组,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1.miR-301a-3p、Cx43在大鼠细菌性脑膜炎脑组织中高表达,且二者呈负相关关系。2.miR-301a-3p agomir转染星形胶质细胞,细胞的增殖能力增加,凋亡能力抑制,因此miR-301a-3p可能在细菌性脑膜炎的发生发展过程中发挥重要作用。3.miR-301a-3p是通过作用于靶基因Cx43 3’UTR区对其进行转录后负调控,从而在细菌性脑膜炎中发挥相应的作用。4.miR-301a-3p有望成为细菌性脑膜炎靶向治疗的位点。