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目的骨骼肌损伤后失治或治疗不当超过2周未愈或持续损伤超过3周称为慢性骨骼肌损伤。慢性骨骼肌损伤是一种常见病多发病,因肌纤维坏死、炎症细胞浸润、微环境紊乱而迁延不愈,常伴有功能障碍和慢性疼痛等病症,严重影响患者正常工作和生活。目前针对慢性骨骼肌损伤的治疗方法有中医治疗、非甾体抗炎等药物治疗、物理治疗(电、激光、热、超声),以上方法可改善患者症状,但治疗时间长、易反复,且有一定的副作用,仍不能达到满意的治疗效果。目前研究显示骨骼肌损伤后可通过肌卫星细胞和骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)再生修复。低强度超声已被证实可促进干细胞迁移、增殖及分化,已有研究者将其用于骨骼肌损伤治疗,但对机制仍缺乏深入研究。本研究采用了可以聚焦的低强度超声(Low-intensity focused ultrasound,LIFU)仪器-阿是超声波治疗仪,将超声能量聚焦于新西兰兔和SD大鼠肌肉慢性损伤处进行治疗,观察其单独或联合BMSCs修复损伤的效果并深入研究其机制。本研究的结果将为阿是超声波治疗仪的临床应用提供坚实的理论基础。方法1.采用自由落体重力打击法构建新西兰兔慢性骨骼肌损伤模型。建模成功后分为超声组(n=30)和对照组(n=30)。超声组LIFU连续治疗10d,治疗开始1d、3d、7d、10d以及17d、24d测量两组局部组织压痛阈值,肌组织NF-κB mRNA表达水平及炎症因子前列腺素E2(PGE2)、白介素-1β(IL-1β)、5-羟色胺(5-HT)浓度;测量两组治疗第1d、第3d、第7d和第10d治疗前后β-内啡肽(β-EP)浓度变化。2.采用自由落体重力打击法制造SD大鼠慢性骨骼肌损伤模型。HE染色法观察正常组和模型组组织病理,判断模型是否成功。其余损伤模型随机分为对照组(n=30)、超声组(n=30)、细胞组(n=30)、及联合组四组。对照组假治疗;超声组LIFU连续治疗14d;细胞组在造模成功后尾静脉注射BMSCs 10×10~6个后,用LIFU假治疗;联合组注射BMSCs后LIFU连续治疗14d,治疗方法和时间与超声组相同。于治疗开始3d、7d、10d、14d和21d、28d采用HE染色法观察组织变化,免疫组化法观察辅肌动蛋白(α-Actinin)、生肌决定因子(Myf-5)以及波形蛋白(Vimentin)表达和免疫荧光法观察肌分化因子(MyoD)和肌细胞生成素(Myogenin)蛋白表达,图像分析软件进行定量分析;RT-qPCR定量局部MyoD mRNA表达;ELISA检测血清基质衍生因-1(SDF-1)浓度变化。结果1.成功建立兔慢性骨骼肌损伤模型。模型组和正常组相比,炎症水平均显著升高(P<0.05),痛阈值明显降低(P<0.05),但血清β-EP水平无明显差异(P>0.05)。超声组痛阈值随着治疗的进行呈下降趋势,治疗第3d、7d、10d和17d、24d均明显低于对照组(P<0.05)。超声组血清β-EP浓度显示,在第1d、3d、7d、10d超声治疗后明显高于治疗前(P<0.05),对照组治疗前后无明显差异。炎症调节因子NF-κB mRNA于治疗开始3d、7d、10d以及17d、24d相对表达量均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。肌肉组织匀浆炎症因子测量结果显示,超声治疗后,炎症水平均低于对照组。5-HT及PGE2在治疗开始3d、7d、10d和17d均明显低于对照组(P<0.05)。治疗第3d至24d,超声组IL-1β水平均明显低于对照组(P<0.05)。结果提示LIFU可缓解模型兔因慢性骨骼肌损伤炎症造成的疼痛。2.成功建立大鼠慢性骨骼肌损伤模型。HE染色图片显示,对照组和细胞组肌纤维断裂、萎缩,炎症细胞浸润、纤维组织增生明显;细胞组可见新生肌细胞。超声及联合组纤维排列整齐,肌纤维萎缩减轻,有轻微纤维组织增生伴炎症细胞浸润减少。α-Actinin、Myf-5免疫组化染色及MyoD、Myogenin免疫荧光染色AOD值和MyoD mRNA表达水平提示,超声组和联合组新生肌细胞在各个时间点均高于对照组,治疗期间与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);细胞组在治疗开始3d、7d、10d新生肌细胞数量明显高于对照组(P<0.05);联合组在3d、7d、10d、14d时显著高于细胞组(P<0.05),在治疗7d、10d后显著高于超声组。超声组于治疗3d、7d、14d时部分AOD值显著高于细胞组(P<0.05)。超声组Vimentin免疫组化AOD值提示,对照组纤维组织增生在各个时间点均高于超声组、联合组和细胞组,呈上升趋势。超声组和联合组在治疗开始3d、7d、10d、21d显著低于对照组(P<0.05);细胞组在治疗开始3d、7d、10d明显低于对照组(P<0.05);联合组AOD值显示各个时间点均低于超声组和细胞组,但差异不显著(P>0.05)。超声组血清SDF-1浓度在治疗开始后3d、7d、14d明显高于对照组(P<0.05);除外治疗第10d,联合组在其余时间点均显著高于对照组(P<0.05);细胞组于治疗第3d、14d以及治疗结束后第7d、14d的SDF-1水平均低于对照组,其中治疗第3d、14d及21d差异有统计学意义(P<0.05);细胞组于治疗第7d、10d高于对照组,第7d差异显著(P<0.05);联合组SDF-1水平均高于超声组,在第14d和21d差异有统计学意义(P<0.05);除第7d外,其余时间点联合组均高于细胞组,且在治疗第3d、14d和21d有统计学差异(P<0.05)。结果提示LIFU单独和联合BMSCs治疗能刺激损伤部位肌源性细胞活化分化为肌细胞并减轻纤维组织增生,有利于组织结构修复。结论1.LIFU治疗慢性骨骼肌损伤的机制主要为下调慢性骨骼肌损伤局部炎症水平,同时刺激机体释放镇痛物质β-内啡肽进入血液。2.LIFU治疗大鼠慢性骨骼肌损伤后明显增加新生肌细胞数量,减少纤维组织增生,有利于损伤组织结构修复。LIFU联合BMSCs治疗慢性骨骼肌损伤,血清SDF-1水平呈较高水平,提示联合治疗有利于持续调动BMSCs归巢,有利于组织修复,值得进一步探讨。3.本课题为LIFU作为一种缓解疼痛、促进肌肉慢性损伤修复的新的技术手段未来广泛应用于临床打下了坚实的理论依据。