研究目的组织工程骨为临床大段骨缺损的治疗提供了可能,同时也避免了自体骨、异体骨移植所带来的不利因素,如供区疼痛,感染,排斥反应等。血管化组织工程骨的提出一方面是基于临床实践的成功经验,另一方面是为构建更符合生理学要求的组织工程骨奠定基础。血管不但能向骨组织提供足够的营养物质,同时也是骨损伤修复和再生过程中的一个重要因素。目前构建血管化组织工程骨的方法很多,其中血管束植入法是目前研究较多的构建方法之一。前期的大量实验研究显示,通过将血管束植入组织工程骨内,可以借助植入的血管束芽生出新生血管来促进组织工程骨的血管化进程,但是,植入的血管束是如何促进新生血管的再生的,目前这一机制尚未阐明。有人推测血管束植入后是通过增加骨缺损局部VEGF的释放来促进新生血管的再生并进一步促进骨缺损的修复。因此,本实验通过采用免疫组织化学染色,荧光定量PCR,western blot的方法追踪在血管化组织工程骨模型中,骨缺损局部VEGF表达量的变化,从而更好地解释血管化组织工程骨促血管再生和促成骨的机制。研究方法1.新西兰大白兔32只(由南方医院实验动物中心供应),4-6个月龄,体重2.0-2.5kg,雌雄不限。。抽取兔自体骨髓,体外培养扩增诱导骨髓基质干细胞至第4代,以10~7/mL的细胞密度接种到直径为12mm,长15mm的多孔β-磷酸三钙圆柱形支架(由法国贝奥路公司供应)上,构成组织工程骨细胞材料复合体,体外培养7d后备用。所有动物均于右侧后肢股骨前外侧做一纵形切口,分离显露股骨。股骨前侧放置已塑形好的6孔普通钢板,于钢板第2、5孔之间截取15mm长股骨,骨缺损处嵌入组织工程骨后依次缝合伤口。再于股骨内侧中央做一小的纵切口,逐层切开,在股三角内显露和分离出大隐神经和股血管束(兔大隐神经为股神经的延续,与股血管伴行),将股血管束游离适当距离后植入组织工程骨侧槽中并用线固定为A组(组织工程骨+股血管束植入组);不植入神经和血管束的为B组(单纯组织工程骨)。2.分别于术后2、4、8和12周时处死每组4只动物,完整截取骨缺损侧股骨。以40g/L的多聚甲醛固定,150g/L的乙二胺四乙酸脱钙后石蜡包埋,连续做6μm厚横行及纵行切片,并选取每个标本横行切片两张(为标本上横行四分之一平面和中间二分之一平面)和纵行切片两张(为纵行正中二分之一平面和侧槽侧四分之一平面),对其中的血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor)通过免疫组化染色,荧光定量PCR法,western blot法进行检测。用图像分析软件(Image Pro-Plus 5.0 MediaCybernetics,美国)进行分析。3.数据以(?)±s表示,采用SPSS13.0软件对数据进行分析,用两因素析因设计方差分析对处理因素和时间的主效应和交互效应作统计,若有显著性差异则用单因素方差分析(One-way ANOVA)对同一组间不同时间点的均数进行比较,用t检验对同一时间点各组间两组的均数进行比较,采用SNK法进行多重比较,P＜0.05为有统计学差异结果1.组织学观察及统计学分析对植入物区新生骨组织评分结果的统计学分析显示随着时间的延长,新生骨组织都有不同程度的增多,差异有统计学意义(F=471.55,P＜0.05)。各组间的新生骨组织量有显著性差异(F=224.64,P＜0.05)。时间点与血管束植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=34.51,P＜0.05)。对各个时间点用SNK法行多重比较可见,实验组新生骨组织的面积比均高于对照组。2.VEGF的免疫组化染色及统计学分析对植入物区新生骨组织内VEGF的积分灰度值进行统计学分析显示,随着时间的延长,新生骨组织内VEGF的表达都有不同程度的变化,差异有统计学意义(F=155.95,P＜0.05)。各组间的新生骨组织内VEGF的表达量有显著性差异(F=681.78,P＜0.05)。时间点与血管束植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=59.51,P＜0.05)。对各个时间点用SNK法行多重比较可见,在4周时血管组VEGF的表达量达到最大值,8周时开始下降,同时各时间点VEGF的表达量实验组均高于对照组。3.VEGF mRNA表达量的检测及统计学分析对植入物区新生骨组织内VEGF mRNA的表达水平进行统计学分析显示,随着时间的延长,新生骨组织内VEGF mRNA的表达都有不同程度的变化,差异有统计学意义(F=71.66,P＜0.05)。各组间的新生骨组织内VEGF mRNA的表达量有显著性差异(F=1121.07,P＜0.05)。时间点与血管束植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=17.38,P＜0.05)。对各个时间点用SNK法行多重比较可见,在4周时血管组VEGF mRNA的表达量达到最大值,8周时开始下降,同时各时间点VEGF mRNA的表达量实验组均高于对照组。4.VEGF western blot检测及统计学分析对植入物区新生骨组织内VEGF的表达水平进行统计学分析显示,随着时间的延长,新生骨组织内VEGF的表达都有不同程度的变化,差异有统计学意义(F=110.78,P＜0.05)。各组间的新生骨组织内VEGF的表达量有显著性差异(F=2641.51,P＜0.05)。时间点与血管束植入之间存在的交互效应有统计学意义(F=75.33,P＜0.05)。对各个时间点用SNK法行多重比较可见,在4周时血管组VEGF的表达量达到最大值,8周时开始下降,同时各时间点VEGF的表达量实验组均高于对照组。结论1.与单纯组织工程骨相比,植入血管束的组织工程骨随时间推移新生成骨量逐渐增加。术后2周时,对照组与实验组的成骨量无显著差异,主要以纤维组织和新生血管为主,术后4周、8周、12周实验组成骨量明显多于对照组。骨缺损处主要以软骨内成骨的方式进行修复的。2.随时间推移,血管组新生骨组织成熟较对照组更为明显,12周时可见新生骨组织分泌大量Ⅰ型胶原,而对照组仍以相对较幼稚的Ⅱ型胶原为主。3.血管束植入组术后2周可见材料孔隙中出现管腔较大的新生血管,对照组中新生血管则相对较少,主要以纤维组织为主。随时间推移,12周时可见血管管径缩小,血管结构更加成熟。4.在血管化组织工程骨组中,VEGF的表达量随时间变化而变化,并且各时间点实验组VEGF的表达不论是基因水平还是蛋白水平均高于对照组,说明血管束植入组织工程骨内可明显促进内源性VEGF的表达。5.实验组VEGF的表达在术后2周时开始升高,4周时达到最大值,8周,12周时开始下降,而本实验室前期研究发现,血管束植入组织工程骨内可见新生血管数随时间推移而逐渐增多,故认为VEGF是早期刺激血管再生的重要因子。6.实验组术后8周,12周时虽然VEGF表达量开始下降,但仍明显高于对照组,并且维持在相对较高水平,同时8周,12周时可见明显软骨内成骨的现象,所以认为VEGF有促软骨内骨化的作用。