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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一种由镰刀菌属菌株产生的非甾体伴雌激素样作用的霉菌毒素,其污染遍布世界各地。ZEA的毒性作用见于生殖系统、内分泌系统和免疫系统等,但相关机制尤其是分子机制还没有完全探明。目前,关于ZEA暴露对动物免疫细胞中T淋巴细胞活化功能的研究报道较少,为探究ZEA免疫毒性的机理,本实验以分离的小鼠原代T淋巴细胞为材料,研究了 ZEA对T细胞体外活化的信号转导通路以及活化过程中相关免疫功能的影响。1.ZEA对小鼠T淋巴细胞活性及活化标志信号的影响采用免疫磁珠负性分选等技术从6-8周龄Balb/c小鼠脾脏中分离获得原代T淋巴细胞,以0(空白对照),2.5,5,10,20,40,80μM的ZEA同时处理未添加/添加活化剂ConA(5μg/mL)的淋巴细胞48h、72h、96h,CCK-8法检测ZEA对T细胞活力的影响;96孔U型底培养板培养细胞观察细胞聚团现象;流式细胞术检测ZEA对T细胞各期活化分子的表达。结果显示,未添加ConA的各染毒组T细胞的活性与对照组相比均无明显变化(p>0.05);Con A对照组与空白对照组相比细胞活性均明显上升(pp<0.01);48h时20μM ZEA及以上浓度处理组细胞活性均明显低于Con A组(p<0.05或p<0.01),72h及96h时1 0μM ZEA及以上浓度处理组细胞活性均较ConA组极显著下降(p<0.01),并呈剂量-效应关系。96孔U型培养板培养72h后,空白对照组细胞几乎看不到克隆团,ConA组出现了大量的克隆团;10μMZEA处理组细胞聚团现象受到抑制,20μM及40μMZEA处理组细胞聚集团开始产生皱缩。双荧光染色流式检测显示,与空白对照组比较,ConA组T细胞早、中、晚期活化标志蛋白CD69、CD25、CD71均有大量表达(p<0.01);与ConA对照组相比,10μM ZEA及以上浓度处理组T细胞CD69、CD25、CD71阳性表达率均有下降(p<0.05或p<0.01),并呈剂量-效应关系。2.ZEA对TCR信号通路的影响以小鼠原代T淋巴细胞为材料,设立空白对照组(不含ConA)、ConA(5μμg/mL)对照组、ZEA(20 及 40μM)+ConA(5μg/mL)处理组,共同处理 24h 后,利用 westernblot方法检测TCR信号通路中接头蛋白LAT的表达水平,活化起始调控蛋白Lck、Zap-70的表达和磷酸化水平,T淋巴细胞活化核因子NF-AT通路和NF-κB通路关键蛋白的表达水平,以及核因子NF-AT和NF-κB入核表达的情况;利用流式细胞术分析了不同浓度ZEA(10、20及40μM)对ConA刺激下的T淋巴细胞TCR通路中共刺激分子CD28、CD152的影响。westemblot检测不同浓度ZEA(20μM及40μM)对ConA刺激下的T淋巴细胞活化共刺激分子CD28介导的下游PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响。结果显示,Con A组细胞LAT表达量较空白对照组明显上升(p<0.01),不同浓度ZEA处理组LAT的表达量均较Con A组显著下降(p<0.01),不同浓度ZEA处理组Lck、Zap-70的表达水平及其磷酸化水平均较Con A组下降(p<0.01)并呈现剂量-效应关系,不同浓度ZEA处理组活化核因子NF-AT、NF-κB通路中关键蛋白的表达量及它们入核表达水平均较ConA组下降(p<0.05)。随ZEA染毒浓度的升高,细胞CD28的表达水平呈下降趋势,40μM ZEA处理组较Con A组差异显著(p<0.05);10、20μM ZEA处理组细胞CD152分子的表达水平均较Con A组显著下降(p<0.05),40μM ZEA处理组细胞CD152表达水平较Con A组却差异不显著(p>0.05)。不同浓度ZEA处理组细胞CD28介导的下游PI3K-Akt-mTOR信号通路中关键蛋白的表达量均较Con A组显著下降(p<0.05或p<0.01)。3.ZEA对活化T细胞细胞因子、趋化因子分泌及趋化因子受体表达的影响以小鼠原代T淋巴细胞为材料,设立空白对照组(不含ConA)、ConA(5μng/mL)对照组、ZEA(10、20及40μM)+Con A(5μg/mL)处理组,共同处理培养48h、72h后,利用流式液相多重蛋白定量技术检测细胞因子IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、GM-CSF及趋化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平;染毒培养24h后,利用流式细胞术检测T淋巴细胞趋化因子受体CCR2和CCR7的表达。结果显示,ConA组细胞因子IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF及趋化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平均较空白对照组极显著升高(p<0.01),各浓度ZEA处理组IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF等五种细胞因子的分泌均较ConA组极显著下降(p<0.01)且呈剂量-效应关系;随ZEA染毒浓度的升高,细胞趋化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平呈下降趋势,20μM ZEA及以上浓度处理组MIP-1α分泌量较Con A组显著降低(p<0.05),40μM ZEA处理组RANTES分泌量较Con A显著降低(pp<0.05);流式双染结果显示,Con A组T细胞趋化因子受体CCR2和CCR7的表达量均较空白组极显著升高(p<0.01),随ZEA染毒浓度的升高,T细胞趋化因子受体CCR2和CCR7的表达量均呈下降趋势,20μM ZEA及以上浓度处理组CCR2表达量较Con A组显著降低(p<0.05),40[μMZEA处理组CCR7表达量较ConA组显著降低(pp<0.05)结论,ZEA可通过干扰TCR及共刺激信号通路抑制经Con A刺激的T淋巴细胞活化过程,同时可以抑制活化T淋巴细胞分泌细胞因子及趋化因子的功能,并在一定程度上抑制T细胞参与的趋化效应,从而导致动物机体发生免疫抑制。