【摘 要】
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[目的]探讨DUSP28在肝细胞肝癌（Hapatocellular Carcinoma,HCC）细胞株中的表达差异,通过设计靶向干扰DUSP28 shRNA慢病毒载体,筛选稳定敲低目的基因的HCC细胞株,研究敲低DUSP28对HCC细胞株表型的影响,从而为研究DUSP28在HCC发生发展中的作用奠定基础。[方法]1.设计三对靶向DUSP28基因的shRNA的干扰序列和一对阴性对照序列,将其分别连接
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[目的]探讨DUSP28在肝细胞肝癌（Hapatocellular Carcinoma,HCC）细胞株中的表达差异,通过设计靶向干扰DUSP28 shRNA慢病毒载体,筛选稳定敲低目的基因的HCC细胞株,研究敲低DUSP28对HCC细胞株表型的影响,从而为研究DUSP28在HCC发生发展中的作用奠定基础。[方法]1.设计三对靶向DUSP28基因的shRNA的干扰序列和一对阴性对照序列,将其分别连接至经双酶切后的线性化pLKO.1载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆后扩增提取质粒,质粒PCR鉴定之后送测序鉴定。将测序正确的载体质粒与辅助包装质粒共转染至293T细胞,获取慢病毒。2.挑选出干扰效率最高的shRNA慢病毒序列用于后续细胞功能实验,采用QPCR法检测慢病毒感染后HCC细胞DUSP28 mRNA转录情况,Western Blot法检测DUSP28蛋白表达量,transwell侵袭实验和细胞划痕实验观察DUSP28的表达对细胞侵袭和迁移的影响,CCK-8测定细胞的增殖情况。[结果]1.DUSP28 shRNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定酶切之后的载体质粒pLKO.1与shRNA序列连接,成功测序载体质粒。293T细胞包装慢病毒,超速离心收集慢病毒浓缩液,用于后续细胞实验。2.DUSP28 shRNA慢病毒感染HCCLM3细胞及稳定转染细胞筛选筛选出DUSP28 mRNA跟蛋白表达最高的HCC细胞株为HCCLM3。使用DUSP28 shRNA慢病毒感染HCCLM3,嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞成功。QPCR验证稳转株细胞中DUSP28 mRNA转录与对照组相比沉默效率达到80%以上（p<0.05）;WB验证表明稳转株细胞中DUSP28蛋白水平与对照组相比显著降低（p<0.05）。3.稳定转染细胞功能实验抑制HCCLM3细胞DUSP28表达后,划痕愈合实验中划痕愈合面积减小,小室侵袭实验细胞从无血清一侧穿梭至血清一侧的细胞数量减少,CCK-8实验表明细胞增殖能力减弱。[结论]我们利用慢病毒载体构建了人DUSP28 RNA干扰载体且在体外实验鉴定成功,并且成功筛选出了稳定转染细胞株;抑制DUSP28表达能抑制细胞迁徙、侵袭、增殖。
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