几种无融合苹果砧木离体再生及其遗传转化体系的建立

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jessicazrz
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栽培苹果主要通过嫁接繁殖,砧木是苹果抗逆性、生长发育及产量和品质形成的基础,砧木的繁育和遗传改良是苹果生产中的重要工作之一,而砧木离体材料的高效再生及其遗传转化体系的建立,可为砧木材料扩繁及遗传改良奠定基础。本研究选择平邑甜茶、锡金海棠、‘小金三号’、‘青砧一号’及平邑甜茶突变体和杂种后代等几种无融合砧木,通过对再生因素的选择与优化,建立了它们离体材料的高效再生体系及锡金海棠的遗传转化体系。主要结果如下:1.锡金海棠子叶及叶片离体高效再生体系的建立锡金海棠近轴端子叶的再生频率是远轴端的1.5倍。最佳暗培养时间为14d。诱导愈伤组织最佳培养基:SC+2.0mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA;愈伤组织分化的最佳培养基:SC+1.5mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA;增殖培养基:SC+2.0mg·L-1BA+0.2mg·L-1NAA,平均的增殖倍数为3.2。将叶片垂直于主脉横切数刀,近轴面接触培养基,最佳分化培养基:SC+6.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA+0.2mg·L-1ZT,再生频率达100%;最佳生根培养基:1/2MS+1.0mg·L-1IBA+20g·L-1蔗糖+6.0g·L-1琼脂(pH为5.8);炼苗后,移入V珍珠岩:V花生壳:V草炭=1:1:1的基质中,20天后移栽成活率高达90%。2.‘青砧一号’离体叶片高效再生体系的建立远轴面接触培养基比近轴面再生频率高,最佳分化培养基:MS+5.0mg·L-16-BA+0.3mg·L-1NAA,叶片再生频率达70%,平均再生芽数为1.9;最佳暗培养时间为14d;最佳继代增殖培养基:MS+1.0mg·L-1BA+0.1mg·L-1IAA+蔗糖20g·L-1+琼脂6.0g·L-1(pH为6.2),不定芽的增殖倍数为2.7;最佳生根培养基:1/2MS+1.0mg·L-1IAA+蔗糖20g·L-1+琼脂6.0g·L-1(pH为6.2),生根率达100%,平均生根数达5.7条。3.‘小金三号’子叶不定芽的诱导分化及植株再生‘小金三号’近轴端子叶的再生频率较高;最佳不定芽诱导分化培养基:SC+TDZ1.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1,子叶再生频率最高可达60%,平均再生芽数为2.2。最佳暗培养时间为21d;最佳继代增殖培养基:MS+1.0mg·L-1BA+0.1mg·L-1IBA+蔗糖20g·L-1+琼脂6.0g·L-1(pH为6.2);最佳生根培养基:1/2MS+1.0mg·L-1IBA+蔗糖20g/L+琼脂6.0g·L-1(pH为6.2),生根率达84.2%,平均生根数达14.2条。4.平邑甜茶及其突变体和杂交后代不定芽的诱导分化平邑甜茶子叶最佳不定芽诱导分化培养基:SC+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA,叶片再生频率达83.3%,平均再生芽数为2.6个。平邑甜茶的突变体C3和其杂交后代314均在附加0.5mg·L-16-BA、0.3mg·L-1NAA时再生频率达到最高,分别为65%,50%;平均再生芽数分别为2.69,1.2。以C3为试材,TDZ的再生效应高于6-BA,当NAA浓度为0.3mg·L-1,TDZ浓度为2.0mg·L-1时,再生频率高达83.3%,平均再生芽数为1.6个。5.锡金海棠遗传转化体系的初步建立以锡金海棠的叶片为外植体,预培养2-3d,在菌液中(OD600=0.4)浸泡5-8min,共培养2-3d后转入附加400mg·L-1Cef的再生培养基中进行抑菌培养,暗培养结束后转至光下培养,诱导分化出不定芽后,转至附加5mg·L-1Kan的分化培养基上初步选择,继而在附加40mg·L-1Kan的增殖培养基上进一步抗性筛选,得到抗性植株。6.嘎啦遗传转化体系的优化与完善嘎啦叶片在MS+5.0mg·L-1BA+0.4mg·L-1NAA培养基上预培养2-3天,菌液(OD600=0.2-0.3)中浸染20min(AS浸染前4-6h加入),共培养3d,转至附加200mg·L-1Cef的再生培养基抑菌培养,暗培养结束后置于光下培养,分化出不定芽后,将不定芽转至附加10mg·L-1Kan、250mg·L-1Cef的增殖培养基进行增殖培养,待幼苗长到一定高度,置于附加40mg·L-1Kan、200mg·L-1Cef的增殖培养基上进行抗性筛选,获得抗性植株并进行分子相关检测。7.平邑甜茶遗传转化体系的建立平邑甜茶子叶在MS+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA培养基上预培养2-3d,菌液(OD600=0.5)浸染5-8min,共培养5d,暗培养结束后转移至光下培养,初期在附加400mg·L-1Cef的分化培养基上抑菌培养,待幼苗长到一定高度后,转至附加20mg·L-1Kan、400mg·L-1Cef的分化培养基进行抗性筛选,获得抗性植株。8.遗传转化体系的验证通过根癌农杆菌介导法,将DAD基因分别导入锡金海棠、嘎啦中,获得抗性再生植株,通过Kan抗性生物学检测和PCR鉴定抗性芽分化率分别达到5.9%、5.5%。
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