新生儿坏死性小肠结肠炎（Necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿期较为常见和严重的肠道疾病，多见于早产儿和极低出生体重儿。其发病机制尚不明确，且无确切有效的治疗方法。目前公认NEC的发生可能与早产、配方乳喂养、致病菌定植、肠道缺氧缺血等多种因素有关，而这些危险因素最终均会引起肠黏膜的炎症级联反应，引起肠组织的炎症性、出血性坏死、肠上皮细胞凋亡等。大量研究表明， miRNA参与很多重要的病理和生理过程，如发育、细胞迁移、增殖、坏死、凋亡等。在肠道疾病方面，miRNA可以通过多种途径调节肠道炎症及免疫反应。由此可见miRNA在肠道疾病的发生发展中起重要作用，但对于miRNA表达与NEC之间的关系国内尚少有相关文献报道。因此，本研究拟采用Illumina二代高通量测序技术（next generation sequencing,NGS）筛选NEC中有显著差异的miRNAs，从而阐明NEC的miRNA调控机制，为研究NEC的发病机制提供新的思路，同时为NEC的诊断和治疗提供新的靶点。　　目的:　　1．用Illumina高通量测序技术对NEC组和正常对照组新生儿外周血白细胞miRNA进行测序，构建NEC组与对照组间小RNA文库。比较NEC组和对照组间miRNA的表达差异，筛选出有显著性差异的miRNA。　　2．通过实时定量PCR与生物信息学方法对NEC患儿外周血白细胞miRNA进行鉴定与功能分析，为今后进一步研究NEC的miRNA调控机制建立一定的分子基础，同时为NEC的诊断和治疗提供新的靶点。　　方法:　　1．NEC外周血miRNA差异表达分析。随机选取对照组与NEC组的外周血白细胞样品各5例，通过Illumina二代高通量测序平台Hiseq2500对NEC组和正常对照组新生儿外周血白细胞样本的miRNAs进行深度测序分析，筛选出有显著差异的miRNAs。　　2．miRNAs差异表达的验证。RT-PCR扩大样本量验证miRNAs在NEC组和正常对照组间的差异表达，用2-△△Ct表示miRNA的相对表达量。　　3．应用相关软件对显著差异表达的miRNA进行生物信息学分析。基于差异表达的miRNA，在RNAhybrid、miRanda、targetscan、PITA数据库中进行预测，取交集作为预测结果，得到差异miRNA调控的所有靶基因，基于Gene Ontology数据库和KEGG数据库进行GO注释和Pathway注释，采用超几何检筛选出差异基因富集的显著性GO和Pathway Term。　　结果:　　1．NEC外周血白细胞miRNA差异表达　　高通量测序分析发现，NEC组与正常对照组中有482个已知miRNAs表达存在差异(P＜0.05)，以p＜0.01，q＜0.001，丨Log2fold change丨≥1（即差异倍数上调≥2倍和下调≤0.5倍）为筛选标准，筛选出有显著差异的126个已知miRNAs，其中上调58个，下调68个。同时也新发现2个miRNA，即表达上调的chr1_26673_5p和表达下调的 chr6_70501_3p。筛选出在各组中表达稳定并且表达差异高的已知miRNAs行RT-qPCR验证，即在测序结果中上调的has-miR-223-5p，-183-3p，-222-5p以及下调的has-miR-23b-5p，-150-5p，-146a-3p，-1298-5p行RT-PCR验证。　　2．RT-PCR扩大样本量验证miRNAs的差异表达　　针对测序结果筛选出要验证的miRNA，采用RT-PCR对20例NEC和20例正常对照组新生儿的外周血白细胞 miRNA进行验证。与正常对照组比较， has-miR-223-5p，-183-3p，-222-5p在NEC组中的表达显著上调；has-miR-23b-5p，-150-5p，-146a-3p，-1298-5p在NEC组中表达显著下调，与测序结果一致，差异有统计学意义（p＜0.05）。　　3．显著差异表达的miRNA的生物信息学分析　　采用靶基因预测软件预测126个已知miRNAs的靶基因，共有6344个靶基因，这些靶基因参与的GO生物学过程有78项，分子功能有12项，同时也参与了61条通路，如Toll样受体、NOD样受体、NF-κB、血管内皮生长因子、FcγR-介导吞噬作用、MAPK、B细胞、T细胞受体、JAK-STAT等信号转导通路参与NEC的发病，而这些通路与肠道免疫、炎症反应、肠道屏障功能、细胞增殖和凋亡等相关。对miR-223-5p行生物信息学分析发现，miR-223-5p的靶基因主要有NLRP3、CLDN8、FOXO3a、ICAM1等，这些靶基因参与肠道上皮细胞凋亡、炎症反应、先天免疫应答反应、肠道屏障构成等。　　结论:　　1．应用Illumina二代高通量测序技术成功筛选出NEC患儿中有显著性差异的miRNAs，NEC组与正常对照组中有显著差异的128个miRNAs，上调59个，下调69个，其中新预测的miRNA有2个。为miRNA在新生儿NEC发病中的作用研究提供了新的参考资料。　　2．这些差异表达的miRNA可能通过多个靶基因和信号通路参与肠道先天免疫应答反应、炎症反应、肠道屏障功能、肠上皮细胞增殖和凋亡、炎症细胞的活化等。为今后进一步研究NEC的miRNA调控机制建立了一定的分子基础。　　3．通过采用stem-loop RT-PCR方法扩大样本量对个体间表达稳定并且表达差异高的7个已知miRNAs进行单个样本差异分析，has-miR-223-5p，-183-3p，-222-5p， has-miR-23b-5p，-150-5p，-146a-3p，-1298-5p的验证结果与测序结果一致，说明测序结果可靠。功能学预测提示 miR-223-5p可能参与 NEC肠道炎症和免疫的调控，有望成为疾病治疗和诊断的新靶点和分子标记物。