PLCE1对食管癌细胞侵袭转移及增殖的影响

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食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,是人们研究最少并且危害最大的肿瘤之一,也是世界上最常见的消化道肿瘤之一,占所有恶性肿瘤的2%。近些年通过大型临床标本收集以及全基因组关联分析发现PLCE1基因与食管鳞状细胞癌的易感性有着密切的关联,但PLCE1在食管癌的发生发展中的生化特性还不完全清楚,还有待进一步阐明。所以我们对食管癌细胞系的PLCE1基因进行敲除,研究其在肿瘤发展中的具体作用。  目的:  探讨PLCE1基因敲除后对食管癌细胞增殖能力及侵袭转移的影响及其相关机制。  方法:  用Crisper/Cas9基因编辑技术对食管癌细胞系的PLCE1基因进行敲除,并应用基因测序、qPCR及Western blot对敲除细胞系进行检测,保证在敲除细胞系中PLCE1蛋白不表达。基因敲除后应用划痕实验、Migration实验及Invasion实验检测食管癌细胞侵袭转移能力的变化;CCK-8法及裸鼠荷瘤实验检测基因敲除前后食管癌细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测食管癌基因敲除前后细胞周期改变;全基因组RNA测序技术和qPCR检测基因敲除前后食管癌侵袭及增殖相关mRNA表达水平变化;Western blot检测基因敲除前后EMT相关蛋白表达变化及snail在核浆分布变化。  结果:  通过基因测序发现用Crisper/Cas9基因编辑技术对食管癌细胞系PLCE1基因进行敲除后,其外显子碱基增加或减少个数都不是3的倍数,实现了对PLCE1基因的移码突变。并通过qPCR及Western blot对敲除后食管癌细胞系进行检测,PLCE1基因敲除后PLCE1的mRNA表达明显降低,PLCE1蛋白不表达。划痕实验、Migration实验及Invasion实验结果显示敲除后的食管癌细胞系与对照组相比,其侵袭转移能力明显下降。通过CCK-8实验发现PLCE1基因敲除后,食管癌细胞增殖能力明显下降;裸鼠荷瘤实验显示PLCE1基因敲除后,瘤块增长能力明显下降。全基因组RNA测序技术和qPCR实验检测发现PLCE1基因缺失后食管癌侵袭及增殖相关mRNA表达水平明显下降。利用Western blot进一步发现PLCE1基因缺失后,snail、β-catenin、zo-1及Vimentin蛋白表达明显下降。通过核浆分离技术及共聚焦显微镜技术发现snail在PLCE1基因敲除后,其在核浆分布情况发生明显变化,snail在细胞核分布明显降低。  结论:  通过Crisper/Cas9基因编辑技术可以实现对食管癌细胞系PLCE1基因的敲除。PLCE1基因缺失可明显降低食管癌细胞的增殖能力,提示PLCE1基因可能参与食管癌细胞增殖方面的调控;PLCE1基因敲缺失可明显降低食管癌细胞的侵袭转移能力,可能是通过调节EMT中的snail来影响食管癌的侵袭转移。
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