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金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类广泛存在的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。有研究报道,植物MTs在解除重金属毒害、维持金属离子稳态和清除活性氧(ROS)等方面起重要作用。 本实验以互花米草(Spartina alterniflora Loisel.)为材料,研究了互花米草幼苗在不同浓度CdSO4(0,0.1,0.5,0.8,1.0,3.0,5.0,10.0 mmol/L)处理下SaMT1、SaMT2、SaMT3基因的表达变化及互花米草幼苗根和叶中抗氧化酶活性的变化;克隆了互花米草3个MT基因,分别命名为SaMT1、SaMT2和SaMT3;构建过量表达载体转化拟南芥,对获得的纯合转基因拟南芥进行分子鉴定及重金属耐受性分析;构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21,对重组菌进行重金属耐性和结合特性分析。其主要结果如下: 1.SaMTs的表达参与了互花米草幼苗对CdSO4胁迫的应答 用不同浓度CdSO4处理互花米草幼苗2天,实时定量PCR分析显示SaMT1、SaMT2和SaMT3的转录明显受到CdSO4的诱导。在低浓度CdSO4处理下,SaMT1、SaMT2和SaMT3基因的表达水平随着CdSO4浓度的增加而逐渐升高;高浓度CdSO4胁迫时,表达量又有所下降。 2.在一定浓度范围内,互花米草幼苗可以通过提高抗氧化酶的活性来抵御重金属胁迫 用不同浓度CdSO4处理互花米草幼苗14天后测定各项生理指标。实验结果显示根和叶中MDA含量和相对电导率都持续升高。随着CdSO4浓度的增加,抗氧化酶类(SOD、APX、CAT、POD)的活性出现先升高又下降的趋势。 3.运用RACE方法克隆得到了互花米草SaMT1、SaMT2和SaMT3基因 SaMT1、SaMT2、SaMT3序列的ORF区长度分别为222 bp、246 bp和195 bp,分别编码73、81和64个氨基酸;Blast X分析和系统进化树分析发现SaMT1、SaMT2和SaMT3与其他植物MTs同源性很高,尤其是水稻MTs。 4.SaMTs的表达能够提高转基因拟南芥的抗氧化酶活性,增强重金属抗性 构建植物过量表达载体,渗透法转化拟南芥,分别筛选得到了6个过量表达SaMT1、9个过量表达SaMT2和11个过量表达SaMT3的纯合转基因拟南芥株系。实时定量PCR技术检测转录水平差异,分别选取2个表达量相对较高的株系进行生理指标测定。转基因拟南芥的抗氧化酶活性都比野生型拟南芥高,而MDA含量和相对电导率比野生型低。 5.SaMTs的表达能够增强重组菌的重金属抗性和结合重金属的能力 构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,对重组菌进行重金属耐性和结合特性分析,结果显示在CdSO4胁迫下表达SaMT1、SaMT2和SaMT3的重组菌比对照菌能更好的生长,并且结合Cd的含量分别是对照菌的1.95、2.7和2.17倍。