生物固氮将大气中惰性的氮气还原成为生物可利用的活性氮源，每年向全球农业生态系统输入约60Tg的有效氮素。研究表明参与农业生态系统的生物固氮作用者包括各种自生固氮菌和共生固氮菌。而在众多类型的固氮菌中，甲烷氧化菌的生物固氮活性早在上个世纪就陆续在纯菌培养实验中被发现，近年来在自然环境中也发现甲烷氧化菌来源的固氮基因，表明在自然环境中甲烷氧化菌有可能充当生物固氮重要贡献者。但是，目前的研究仍然没有能够系统地揭示具有固氮基因的甲烷氧化菌在生态系统中的分布规律，也没有提供足够的证据表明这些甲烷氧化菌在复杂的环境条件下能够发挥实际的固氮活性。而在评估许多生态体系中的生物固氮潜力时，甲烷氧化菌的固氮贡献往往受技术方法的限制被广泛忽视。本文针对稻田这一甲烷氧化动力较强的农业生态系统，联合微宇宙培养、13C和15N稳定性同位素示踪以及以转录组为核心的多组学分子生物学技术方法，旨在揭示甲烷氧化过程能够驱动生物固氮的普遍规律，并研究在这一过程中发挥甲烷氧化和生物固氮活性的微生物群落组成和特征。本文的具体内容和结论如下:　　1.由于本研究使用的核心技术之一宏转录组在土壤中的应用还不普遍，不同的方法对微生物转录水平的研究是否具有影响还存在疑问，因此本文首先采用高通量测序技术评价不同的RNA提取方法。针对东北、江苏和江西三种不同母质发育的典型水稻土，采用手工提取法和试剂盒法分别获得了土壤微生物总RNA，分析了RNA的质量并利用高通量测序分析了水稻土活性微生物的群落组成。结果表明:在土壤微生物量较高的东北和江苏水稻土中，试剂盒法的提取总量和纯度高于手工提取法，而土壤微生物量较低的江西水稻土中，手工提取法略优于试剂盒法;利用高通量测序技术评价了手工和试剂盒土壤RNA的提取效果，发现活性微生物群落组成的差异主要来自于土壤类型，而受提取方法的影响较小;进一步以好氧甲烷氧化菌为例分析了活性的水稻土功能微生物类群，发现甲烷氧化菌的群落组成同样取决于土壤类型，而非土壤RNA提取方法。这些研究结果表明:尽管不同提取方法可能影响后续土壤RNA的数量和纯度，但高通量测序发现土壤类型决定了土壤微生物组成，不同方法所得结果基本一致，能够反映主要的活性微生物群落组成。未来土壤宏转录组研究过程中，应结合不同RNA提取方法的特点，优先考虑不同处理可能导致的活性微生物群落差异，最大程度地发挥土壤宏转录组的技术优势。　　2.针对江苏江都的一例水稻土，研究甲烷氧化驱动的生物固氮以及甲烷氧化菌的固氮活性。首先通过设置不同的甲烷和氮素条件比较水稻土壤氧化高浓度甲烷的能力，结果发现在施加200μg N g-1d.w.s.的硝酸铵溶液后，土壤持续氧化高浓度(10000ppmv)甲烷的速率显著提高，表明氮源是重要的甲烷氧化限制因子。随后通过15N2培养水稻土壤，发现在不加外源硝酸铵的条件下，土壤在同化了甲烷来源的碳源后，其中的15N原子丰度显著提高;而向土壤加入外源硝酸铵后，即使氧化了等量的甲烷，土壤的15N原子丰度也没有提高。这表明在土壤本底无机氮含量相对较低的条件下，高浓度的甲烷氧化过程能够促进土壤的生物固氮活性。实验进一步通过基于mRNA的宏转录组研究，发高浓度的甲烷氧化刺激了土壤中甲烷氧化菌的整体转录水平上调，而其中上调幅度最大的是甲烷氧化菌的核心酶甲烷单加氧酶基因以及固氮酶基因的转录;而加入了硝酸铵后，甲烷单加氧酶基因在转录水平被大量刺激，但固氮基因的转录却被抑制。结合DNA-SIP和克隆文库方法对固氮土壤中的功能基因进行测序，结果发现参与高浓度甲烷氧化的微生物主要为Ⅰ型甲烷氧化菌和小部分Ⅱ型甲烷氧化菌，而参与生物固氮的微生物大部分也是甲烷氧化菌，包括Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌。最后，实验通过蛋白质组的研究，发现土壤氧化高浓度甲烷过程中固氮酶的表达量被高度刺激，而这些固氮酶的微生物来源也主要是Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌。实验据此得出结论，在速效无机氮源条件相对较低的条件下，水稻土壤的活性甲烷氧化菌在氧化高浓度甲烷的同时，能够通过自身的生物固氮作用满足自身的氮源需求，并促进土壤的整体固氮活性增加。　　3.针对21例采集于全国不同省份的典型水稻土壤，研究甲烷氧化过程驱动土壤生物固氮作用的普遍性意义。利用15N2和13CH4培养水稻土壤，结果发现18例土壤在氧化大约200000ppmv的高浓度甲烷后，土壤15N原子丰度显著增加，表明高浓度甲烷氧化过程对土壤的生物固氮活性具有普遍的促进作用;通过13C-DNA-SIP实验结果发现被稳定性同位素标记的13C-DNA中同时富集有大量的甲烷单加氧酶(pmoA)和固氮基因(nifH)，表明活性甲烷氧化菌可能同时存在甲烷氧化和固氮相关的功能基因。进一步对13C-DNA进行pmoA基因高通量测序结果发现经过高浓度甲烷培养后，大多数土壤中的Ⅰa型甲烷氧化菌被大量标记，而只有个别土壤的Ⅱ型甲烷氧化菌被大量标记，表明Ⅰa型甲烷氧化菌在水稻土壤氧化高浓度甲烷过程中发挥主要的作用。而对13C-DNA进行nifH基因的测序结果显示很大一部分固氮基因与其中的pmoA基因同源，表明水稻土壤中的活性的甲烷菌在基因水平具有普遍的固氮潜力，它们在实际的生物固氮过程中极有可能发挥主要作用。