高通量核酸测序技术及其在原始现生物种microRNA表达分析中的应用

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MicroRNA通过与mRNAs中的3端非编码区域(untranslated region,UTR)作用,引起靶基因的降解或抑制其翻译,最终达到抑制特定基因表达的目的。3UTR的演化可能与其microRNA的结合位点的减少或者增加有关,从而microRNA可以通过对其靶标的影响在生物演化中起到关键性作用。因此可将microRNA看做是一种研究物种演化发育的标签分子。本论文通过对文昌鱼和舌形贝microRNA的测序,分析了microRNA在原始现生物种中的表达差异,为相关动物类群演化起源的研究提供了基础。  文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum)属于头索动物亚门(Cephalochordata)。比较基因组学研究表明,头索动物亚门是现存脊索动物门(Chordata)中最为原始的亚门。文昌鱼做为头索动物亚门现存的唯一代表,对研究脊索动物早期的演化起源具有重要的生物学意义。本论文中,我们提取成体文昌鱼的总RNA,然后以标准方法特异性提取其中的总MicroRNA,运用东南大学自主研发的AG-100高通量测序平台检测成体文昌鱼的microRNA表达状态,通过逐级分析成体文昌鱼与现生尾索动物(Urochordata)和脊椎动物(Vertebrata)、microRNA分布关系,推测出脊索动物门基因组可能拥有let-7a、let-7b、miR-125、miR-34、miR-184、miR-33和miR-210等7个microRNA,为研究脊索动物门microRNA的演化起源提供研究基础。  腕足动物门(Brachiopoda)是最古老的Bodyplan之一,最早发现于早寒武世,繁盛于志留、泥盆二纪,其后延续至今。多数腕足动物类群现已灭绝,舌形贝(Lingula Bruguire)是仅存的现生腕足动物之一,对探索原口动物与后口动物共同祖先(Protostome-deuterostome ancestor,PDA)的microRNA祖征(Plesiomorphy)状态具有重要的研究价值。本论文中,我们提取成体舌形贝的总RNA,运用东南大学自主研发的AG-100高通量测序平台检测成体舌形贝的microRNA表达状态,逐级分析成体舌形贝与现生触手冠类群(Lophophorata)、冠轮动物(Lophotrochozoa)和所有两侧对称动物的microRNA分布关系。推测出PDA基因组可能拥有let-7、miR-10、miR-133、miR-184和miR-92等5个microRNA,为microRNA在真后生动物(Eumetazoa)亿万年演化历程中的相关变化提供研究基础。  本论文还在实验过程中尝试使用了一种新型的microRNA高通量检测方式。该方法是一种高通量测序与微阵列芯片的组合技术。在完成文昌鱼的高通量测序之后,利用末端转移酶将文昌鱼microRNA转移上荧光,制备成microRNA探针,利用制备完成的探针,与完成测序的芯片进行杂交,对杂交信号进行捕获,并进行了相关分析,从理论性和操作性两方面论证了该方案的可行性。
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