论文部分内容阅读
研究背景:炎症相关的慢性肌肉骨骼退行性疾病(ICMDDs),如骨关节炎和肌腱病,往往会导致活动受限和残疾,并随之带来繁重的社会经济负担,目前的治疗手段包括保守物理治疗,药物抗炎和对以上治疗均无缓解而采取的手术方式。虽然以上治疗方式大多能在短期内缓解症状,但通常不能从根本上解决疾病的发生发展。透明质酸(Hyaluronic acid HA)在关节腔和炎症部位注射是近年来出现的一种在骨骼肌肉系统疾病中常用的治疗手段,但其作为黏弹剂补充材料对疾病的修饰效果和分子机制仍存在诸多争议和不确定因素。研究目的:(1)探究高分子量透明质酸(HMW HA)对成熟C57BL/6小鼠髌下脂肪垫(IFP)/滑膜来源细胞体外培养中,内源性HA合成和分泌的影响。(2)探究HMW HA对IFP/滑膜来源细胞透明质酸结合蛋白多糖(Versican,Aggrecan)合成和代谢的影响。(3)探究HMW HA对IFP/滑膜来源细胞NF–κB信号通路相关炎症因子的影响。(4)探究HMW HA跟骨后囊注射,对TGF-β1诱导的小鼠跟腱炎的潜在治疗效果。研究方法:(1)胶原酶消化处理无菌状态下收集的C57BL/6小鼠IFP/滑膜组织,经DMEM(10ng/mLbFGF,10%FBS)培养6-8天,待细胞融合度达到80%时,给予巨噬细胞生长因子MCSF/GMCSF和LPS刺激细胞炎症反应,分别在有或无HMW HA情况下,利用免疫荧光技术对HA,表面受体CD44,内质网表面标记Calnexin进行定位。(2)实时荧光定量PCR和免疫印迹(WB)技术检测细胞和培养基中核心蛋白Versican和Aggrecan的表达水平。(3)实时荧光定量PCR技术检测HMW HA处理前后相关炎症因子的mRNA的表达。(4)通过小鼠跟骨后囊部位连续两次TGF-β1注射诱导跟腱炎模型,损伤后第二天进行HMW HA注射,在3个不同时间点收获未损伤组和损伤组(未进行HA注射组和注射组)跟骨踝关节,进行HE、Safranin O-Fast Green、bHABP染色,观察HMW HA对受损组织的影响。(5)在3个不同时间点收集模型小鼠跟腱组织,利用MicroArray检测炎症因子的表达。研究结果:(1)HA共聚焦免疫荧光结果显示,在基础培养条件下,IFP细胞中合成的HA大部分定位于细胞内,且很大程度上与内质网/高尔基体有关;在加入LPS刺激后,HA被分泌于细胞表面;加入外源性高分子量HA后,细胞内的HA可分泌至培养基中。(2)免疫印迹结果显示外源性HA能够降低IFP滑膜细胞分泌到培养基中的Versican蛋白的量,对细胞周基质中的Versican的影响不明显;对Aggrecan没有产生明显的影响;荧光定量PCR结果显示外源性HA能够降低Versican mRNA的表达水平,而Aggrecan的mRNA水平升高。(3)实时荧光定量PCR结果显示,LPS刺激后细胞中Prg4,iNOS,Il6基因mRNA表达增高并且外源性HA的加入能够抑制iNOS基因mRNA水平的升高。(4)跟腱炎模型踝关节组织学结果初步显示,炎症急性期高分子量HA的注射能够阻止损伤部位正常组织形态恢复,促进跟骨后囊部位胶原沉积,延缓跟腱炎早期促炎HA基质的清除。(5)MicroArray结果提示在炎症急性期注射外源性高分子量HA,会损伤跟腱组织中的促血管生成和炎症相关因子在第5天表达增加;第9天先天免疫和巨噬细胞激活因子等基因的表达降低;在第25天慢性炎症和纤维化相关基因的表达增加。研究结论:(1)外源性HA可能通过调节细胞内质网/高尔基体相关内源性HA分泌(可能是内质网释放应激反应的标志),多糖蛋白的表达以及NF-κB信号通路分子的表达来调节炎症反应。(2)在小鼠跟腱病变模型中,外源性HA在脂肪基质/跟骨后囊部位的注射会加剧炎症反应,导致邻近组织处于慢性炎症反应状态。(目前正在进一步探究当HMW HA在急性炎症阶段后期注射,对滑囊炎和跟腱病的潜在治疗效果)