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背景:肺癌是我国最常见也是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占85%。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)异常突变与NSCLC的发生和进展有关,因此它被认为是治疗癌症的重要靶标;已开发出的一代酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)厄洛替尼,可明显改善EGFR敏感突变(19缺失或L858R)NSCLC患者的生存。然而在使用厄洛替尼治疗后几乎所有的患者均不可避免地出现了耐药,已发现的TKI耐药机制包括EGFR二次突变T790M、旁路激活、表型转化等。但还有相当部分耐药患者发生的耐药机制尚未阐明,因此,我们进一步探索合适、有效的策略以逆转TKI耐药,进而改善这一部分患者的生存。越来越多的证据表明细胞代谢在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用,其中糖酵解不仅为肿瘤细胞增殖提供了能量,并且其产生的中间产物也是合成肿瘤细胞所需的重要原料,抑制糖酵解可以增强NSCLC对EGFR-TKI的敏感性,并防止耐药的产生。SIRT6是一种蛋白质脱乙酰酶,属于Sirtuins家族,与肿瘤发生、发展密切相关;影响细胞代谢,氧化应激,转录调节,DNA修复等多种生物过程。它可与葡萄糖代谢相关基因和酶直接或间接相互作用,或调节糖酵解的上游因子或途径进而调节细胞的糖代谢水平。前期我们的研究发现NSCLC患者肿瘤组织中SIRT6的表达高于正常组织,且SIRT6高表达组的总生存期(overall survival,OS)较低表达组短。提示SIRT6高表达可能是NSCLC患者的不良预后因子。我们的课题组已成功诱导出了稳定的厄洛替尼耐药的肺腺癌细胞株(PC9/ER、HCC827/ER),并发现在耐药株中SIRT6高表达,且耐药株细胞具有更高糖酵解水平,因此我们推测SIRT6在NSCLC厄洛替尼耐药中发挥了重要作用,其具体作用机制待进一步探讨。方法:1.SIRT6在NSCLC组织的表达情况及其与预后的相关性使用UALCAN进行生物信息学分析,研究SIRT6在肺癌组织、正常的肺组织中的表达情况;使用Kaplan-Meier Plotter获得生存数据,分析SIRT6的表达量与肺癌患者预后的关系。2.SIRT6在NSCLC细胞株中的表达情况CCK-8法检测NSCLC细胞对厄洛替尼的敏感性,确定敏感细胞、耐药细胞对厄洛替尼的敏感性差异后,采用western blot分析SIRT6在敏感、耐药细胞中的表达水平。3.SIRT6改变NSCLC细胞对厄洛替尼的敏感性利用慢病毒转染技术改变细胞株中SIRT6的表达水平,再使用CCK-8法检测SIRT6稳转细胞对厄洛替尼的敏感性,以及用Annexin V/7-AAD检测厄洛替尼干预下,SIRT6稳转细胞的凋亡情况。4.SIRT6通过HIF-1α/HK2信号轴调节NSCLC细胞糖酵解并促进细胞增殖利用慢病毒构建SIRT6过表达细胞株PC9/SIRT6、HCC827/SIRT6,和SIRT6敲低细胞株PC9/ER/shSIRT6、HCC827/ER/sh SIRT6,检测各细胞株产生的乳酸和ATP的含量以反应糖酵解能力,以及Ed U检测SIRT6对细胞增殖的影响,western blot分析HIF-1α、HK2蛋白表达变化。然后改变SIRT6下游分子的表达,检测细胞糖酵解是否发生改变。5.体内实验验证SIRT6诱导NSCLC细胞厄洛替尼耐药SIRT6稳定过表达、敲低的NSCLC细胞株给予裸鼠皮下注射以构建裸鼠成瘤模型,用移植瘤的体积变化来反应厄洛替尼的治疗效果。采用免疫组化染色分析各肿瘤组织中SIRT6、HIF-1α、HK2、ki-67的表达情况。6.统计分析实验数据以均数±标准差计量,利用Graphpad Prism 5.0进行统计分析,两组间变量资料比较采用配对t检验,多组间两两比较,则采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.SIRT6过表达与NSCLC患者预后不良相关使用UALCAN下载TCGA数据库中肺癌患者的基因数据,分析表明SIRT6在肺腺癌和肺鳞癌组织中高表达,提示SIRT6是NSCLC的一个潜在标志物。利用Kaplan-Meier Plotter获得生存数据,结果显示SIRT6高表达与肺腺癌患者不良预后显著相关;表明SIRT6高表达可能是肺癌尤其肺腺癌患者的不良预后因子。2.与NSCLC厄洛替尼敏感细胞株相比SIRT6在厄洛替尼耐药细胞株中高表达研究证实PC9和HCC827细胞对厄洛替尼敏感,而PC9/ER和HCC827/ER细胞对厄洛替尼表现出较强的耐药性。然后,我们通过western blot检测到无论是否使用厄洛替尼干预,SIRT6在PC9/ER和HCC827/ER细胞中高表达。3.SIRT6促进NSCLC细胞厄洛替尼耐药与相应的亲本细胞相比,SIRT6过表达细胞(PC9/SIRT6、HCC827/SIRT6)的厄洛替尼IC50值显著升高,与之相反,SIRT6敲低细胞PC9/ER/shSIRT6、HCC827/ER/sh SIRT6的IC50值则明显降低,并且在厄洛替尼干预下,SIRT6敲低细胞的凋亡增加。4.SIRT6可通过HIF-1α/HK2信号轴调节NSCLC细胞的糖酵解并促进细胞增殖与相应对照组细胞相比,SIRT6过表达细胞PC9/SIRT6和HCC827/SIRT6产生了更多的乳酸和ATP,即使用厄洛替尼干预时,SIRT6过表达细胞产酸、产能的能力仍较强。与此相反,无论是否使用厄洛替尼干预,SIRT6敲低后的耐药细胞PC9/ER/shSIRT6、HCC827/ER/shSIRT6产生乳酸和ATP的水平显著降低,EdU检测结果也表明PC9/SIRT6、HCC827/SIRT6细胞的增殖能力大大提高,而PC9/ER/sh SIRT6、HCC827/ER/shSIRT6细胞的增殖能力则明显降低。我们进一步利用western blot检测了与糖酵解相关的一些基因,发现HIF-1α与HK2的蛋白含量可随SIRT6的升高而升高。因此,我们使用了HIF-1α特异性抑制剂(PX-478 2HCL)来抑制SIRT6过表达细胞(PC9/SIRT6、HCC827/SIRT6)中HIF-1α的表达。当HIF-1α被成功抑制后,HK2的表达也随之降低,同步检测乳酸和ATP的含量也降低,提示HIF-1α抑制剂可成功逆转SIRT6促进的糖酵解。5.SIRT6可在裸鼠体内诱导厄洛替尼耐药与接种PC9/vector细胞组的裸鼠相比,接种PC9/SIRT6细胞组的裸鼠具有更大的移植瘤体积,且其生长不能被厄洛替尼抑制,免疫组化的结果也提示SIRT6过表达肿瘤组织中HIF-1α、HK2的蛋白含量也更高,同时反映增殖的ki-67也升高。而敲低SIRT6组(PC9/ER/shSIRT6细胞组)的裸鼠移植瘤体积则相对较小(与PC9/ER/sh Ctrl细胞组比较),HIF-1α、HK2、ki-67的蛋白含量也随之降低。表明SIRT6可在体内诱导厄洛替尼耐药,并通过HIF-1α/HK2信号轴发挥作用。结论:1.SIRT6在NSCLC患者中高表达并与患者不良预后相关。2.SIRT6过表达可增强NSCLC细胞的糖酵解能力,而敲低SIRT6则降低了NSCLC细胞的糖酵解能力。3.SIRT6通过HIF-1α/HK2信号轴调节糖酵解进而诱导NSCLC厄洛替尼耐药。4.SIRT6过表达可降低厄洛替尼对NSCLC细胞和移植瘤的抑制作用,而敲低SIRT6可恢复厄洛替尼对NSCLC细胞和移植瘤的抑制作用。