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目的:系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种复杂的自身免疫疾病,具有较强的遗传倾向,因此,其患病率和疾病特征性标记在不同种族存在较大差异。SLE同卵双胞胎和一级亲属的患病风险为3050%,是一般人群的20倍。在多米尼加共和国（Dominican Republic,DR）人群中,SLE的发病率和疾病的严重程度都显著高于其他人群。迄今为止,有关多米尼加共和国人群SLE遗传风险因素的研究未见报道。SLE是过量的自身抗体及免疫复合物（immune complexes,ICs）沉积于组织所致。狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）是SLE患者最常见的并发症之一,在SLE患者中的发病率约60%,其中,自身抗体是主要致病因素之一。尽管已经确认了多种SLE相关自身抗体,但至今仍未发现与SLE肾损害相关的自身抗体。本研究通过单核苷酸多态性分析鉴定多米尼加共和国人群中SLE的遗传易感基因SNP,并通过相关分子生物学技术鉴定与SLE和LN疾病活动期相关的抗肾小球系膜细胞（mesangial cell,MC）组分的自身抗体,评估该自身抗体与LN、SLE活动期的相关性以及对MC凋亡的影响,为进一步研究其在LN发病机理提供科学依据。研究方法:一、实验材料1、研究对象:SLE、骨关节炎（osteoarthritis,OA）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者和健康对照者来自于美国内布拉斯加州大学医学中心（University of Nebraska Medical Center,UNMC,Omaha,NE）、多米尼加共和国天主教大学（the Pontificia Universidad Católica Madre y Maestra PUCMM,Santiago De Los Caballeros,Dominican Republic）。SLE患者、狼疮肾炎患者均符合美国风湿病学会（American College of Rheumatology,ACR）相关国际分类标准。患者和健康者血清样品均经机构审查委员会审定,并经本人知情同意后采集。2、细胞系:肾小球系膜细胞（American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,VA,美国）。3、抗体:抗14-3-3 eta山羊多克隆抗体购自Santa Cruz生物技术公司（Dallas,TX,美国）;FITC标记的驴抗人IgG、过氧化物酶标记的驴抗人IgG以及过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG均购自美国Jackson免疫研究所。二、实验方法1、基因型检测:采用Sequenom’s MassARRAY IPLEX基因分型技术分析单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）2、重组抗体的制备:应用单细胞PCR技术制备重组抗体3、细胞培养4、流式细胞仪筛选可与肾小球系膜细胞结合的重组抗体5、竞争实验6、凋亡检测7、免疫沉淀检测8、质谱测定9、Western blot检测10、酶联免疫吸附试验11、统计学分析实验结果:1、SNP分析结果表明,在SLE患者38个候选SNP中,9个非HLA基因（分别为ITGAM、BLK、TNFSF4、PTPN22、TNIP1、STAT4、CARD11和TNXB TNFAIP3）;6个HLA基因（分别为HLA-DQA1、HLA-DRB2、HLA-DRA、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLA-DQB1）的19个SNP分布与对照组存在显著性差异。HLA-DRA单体型A-T与LN有关且这种单体型在LN中存在基因剂量效应。ITGAM的纯合基因型“AA”与多米尼加人群LN显著相关。HLA-DQA2rs2301271和TNFSF4 rs2205960中的“T”等位基因与NPSLE显著相关且这两个等位基因都有明显的基因剂量效应。2、经流式细胞仪检测,利用单细胞RT-PCR技术合成的334个SLE重组抗体中有16个可与肾小球系膜细胞结合。3、应用免疫沉淀结合质谱技术,从MC膜蛋白提取物中鉴定出三个可与16个MC特异结合的重组抗体结合蛋白质,分别是基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白多糖（basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein,HSPG）、氨酰tRNA合成酶复合多功能相互作用蛋白1（aminoacyltRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 1,AIMP1）和14-3-3eta。4、ELISA检测结果显示,16个可与MC结合的SLE重组抗体中,有5个（S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9）可与14-3-3 eta蛋白结合,且吸光度值随抗体浓度增加而增加,呈剂量依赖方式。5、Western blot检测结果表明16个可与MC结合的SLE重组抗体中,有5个（S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9）可与14-3-3 eta蛋白特异性结合。6、竞争实验结果显示,5个重组抗体（S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9）与过量14-3-3 eta蛋白共同孵育后其与MC的反应性部分或完全消失,表明14-3-3 eta介导或部分介导抗体与MC的结合。7、应用ELISA方法检测SLE组和健康对照组血清抗14-3-3 eta抗体滴度,结果显示,不同地区SLE患者血清抗体水平较对照组均显著升高（P<0.0001,P=0.0003）。骨关节炎（osteoarthritis,OA）和类风湿性关节炎患者血清抗14-3-3 eta抗体水平相似（P=0.8756）,均显著高于健康对照组（P=0.0012,P=0.0013）,且均显著低于SLE组（P=0.0027,P=0.0057）。SLE患者中,活动性肾炎组的抗体水平显著高于无活动性肾炎组（P<0.0001）。SLE患者中,抗14-3-3 eta抗体阳性者,其活动性肾炎发病率显著高于抗体阴性者（P<0.0001）。8、凋亡检测结果显示,用SLE来源的5个重组抗体（S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9）或商品化抗体处理MC后,抗14-3-3 eta抗体使MC凋亡率下降,提示抗14-3-3 eta抗体可能通过诱导MC凋亡最终导致LN的发生。结论:1、在多米尼加人群中发现ITGAM、BLK、TNFSF4、PTPN22、TNIP1、STAT4、CARD11、TNXB TNFAIP3、HLA-DQA1、HLA-DRB2、HLA-DRA、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因的19个SNP为SLE易感SNP。同时,发现LN发病相关的高风险性单体型HLA-DRA rs6937545-rs7763262,确定了HLA-DRA2和TNFSF4基因中的等位基因是NPSLE发生的遗传危险因素。2、14-3-3 eta、HSPG和AIMP1是SLE的潜在自身抗原。3、抗14-3-3 eta抗体具有抑制肾小球系膜细胞凋亡的功能。4、抗14-3-3 eta抗体可能是LN和SLE疾病活动性判定的新的生物标志物。