革兰氏阴性菌结合蛋白(Gram-negative Bacteria Binding Proteins，GNBPs)是昆虫体内对入侵病菌具有识别和结合能力的一种模式识别蛋白，在昆虫抵御病原微生物入侵的免疫识别过程中发挥重要作用。为探讨GNBPs在斜纹夜蛾免疫系统中的功能，本研究利用同源克隆结合RACE技术克隆了斜纹夜蛾(spodoptera litura)中GNBPⅡ基因的cDNA全长序列，在体外高效表达，制备了抗血清；利用Real-time PCR对GNBPⅡ基因在斜纹夜蛾体内组织表达差异进行了分析；并利用RNAi技术初步研究了SIGNBPⅡ对斜纹夜蛾抗菌肽的调控。结果具体如下：　　本研究利用同源克隆结合RACE技术克隆了斜纹夜蛾GNBPⅡ基因的cDNA序列(命名为：S1GNBPⅡ)，GenBank登录号为：AEQ33590。S1GNBPⅡ基因全长为1731bp，1-190bp为5’非翻译区，1622-173lbp为3’非翻译区。S1GNBPⅡ基因的开放阅读框全长为1431bp，编码476个氨基酸残基，分子量为53.96 kDa，等电点为5.59。由在线生物学软件SignalP分析表明，S1GNBPⅡ信号肽为前19个氨基酸所组成的肽段，成熟肽的分子量为51.818 kDa，等电点为5.59。同源性分析表明，S1GNBPⅡ与棉铃虫(Helicoverpa armigera)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni H)和家蚕(Bombyx mori)等鳞翅目昆虫高度同源，同源性分别为54％、56％、48％。　　为研究S1GNBPⅡ蛋白结构和功能的关系，本研究利用RT-PCR克隆了S1GNBPⅡ开放阅读框中495bp编码，并与表达载体pET-32a连接，构建了原核表达质粒pET-32a-S1GNBPⅡ，将酶切和测序正确的阳性重组子转化表达宿主菌BL21(DE3)中，在IPTG诱导下进行了高效表达，SDS-PAGE检测表明S1GNBPⅡ在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为33.75 kDa的融合蛋白，与预测的融合蛋白的分子大小相当。Western Blot表明表达的S1GNBPⅡ为N端带有6×His标签的融合蛋白。利用Ni-NTA亲和柱纯化了S1GNBPⅡ蛋白，并免疫新西兰大白兔制备了抗S1GNBPⅡ的兔血清，ELISA效价为1:25600，Western blot检测结果显示，制备的抗血清能特异识别表达的融合蛋白，表明所表达的融合蛋白仍保持原有蛋白质的免疫原性。　　为了研究S1GNBPⅡ的时空表达模式和对不同微生物的敏感性。本研究利用Real-time PCR技术对S1GNBPⅡ的时空表达差异性进行分析。结果显示，S1GNBPⅡ在斜纹夜蛾幼虫各个阶段都有表达，在卵和成虫体内几乎没有表达，四龄表达量显著高于其他龄期。四龄斜纹夜蛾S1GNBPⅡ主要表达部位在脂肪体、血细胞、表皮、中肠，且在脂肪体中表达量最高。对微生物的敏感性研究表明，斜纹夜蛾S1GNBPⅡ能被金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和白僵菌(Beauveria bassiana)三种菌诱导表达，但革兰氏阴性菌大肠杆菌诱导后S1GNBPⅡ的表达量最高，并在12小时表达量达到最大。　　利用RNAi干扰技术初步研究了S1GNBPⅡ在斜纹夜蛾体内的功能。以正常的健康四龄三天的幼虫注射3μg的S1GNBPⅡ dsRNA2、4、6、12、24小时后，利用半定量RT-PCR和Real time PCR检测，结果表明S1GNBPⅡ的转录水平在注射S1GNBPⅡ dsRNA4小时后开始降低，24h达到最低值。在蛋白水平上，以anti-S1GNBPⅡ为抗体，利用Western blot检测RNAi后的S1GNBPⅡ的翻译水平，结果表明血淋巴S1GNBPⅡ蛋白含量也所有降低。为了进一步明确S1GNBPⅡ在抗菌肽产生的信号通路中的功能，选取斜纹夜蛾体内的抗菌肽基因cecropinA、cecropinB和moricin作为检测目标，半定量RT-PCR结果表明，斜纹夜蛾S1GNBPⅡ RNAi干扰24h后引起下游抗菌肽cecropinA、cecropinB和moricin的mRNA转录水平下降，表明S1GNBPⅡ参与了抗菌肽表达的调控。　　以上的研究结果为进一步研究S1GNBPⅡ在斜纹夜蛾免疫系统中的功能奠定基础，也为以免疫系统为基础防治斜纹夜蛾等害虫提供了基因靶标。