目的:本研究通过检测经白芥子涂法穴位贴敷治疗后支气管哮喘豚鼠受乙酰甲胆碱激发实验的呼气阻力、吸气阻力及肺顺应性等指标,观察穴位贴敷对哮喘中气道高敏感性的作用,并从其对气道上皮屏障的保护及神经-炎症级联相关因子在穴位-脏腑分布的的影响,揭示穴位贴敷疗法对哮喘的调节机制,以期为相关新疗法的研发和改进提供理论依据。材料与方法:1、采用卵蛋白致敏法,制备豚鼠过敏性哮喘模型,通过大体观察、肺组织病理切片等指标,观察正常组和哮喘模型组豚鼠差异。并采用乙酰甲胆碱攻击法检测各组豚鼠呼气阻力、吸气阻力及肺顺应性,反应白芥子涂法穴位贴敷对哮喘豚鼠气道高敏感性的作用。2、采用Western Blot法检测肺组织中TGF-β、MMP9、TIMP1、Pan-Cadherin含量,并采用明胶酶谱法检测肺组织中基质金属蛋白酶活性,磷酸化Western Blot法检测肺组织Erk1/2、p38磷酸化水平。从白芥子涂法抑制TGF-β/MAPK/MMPs减少钙黏连蛋白破坏角度,探讨穴位贴敷通过对气道上皮屏障的保护机制抑制哮喘中的气道高敏感性。3、通过病理切片染色检测穴位皮肤经贴敷后的变化,及免疫组化、免疫荧光法检测、免疫印迹法,检测穴位贴敷后穴位皮肤及肺组织中NGF、SP、TRPV1等神经-炎性因子与受体的含量和分布,讨论穴位贴敷通过活化穴位,调控神经-免疫级联,抑制过敏性哮喘。结果:1动物造模与穴位贴敷对气道高敏感性的作用1.1成功制备卵蛋白致敏的豚鼠模型,且穴位贴敷显效。1.1.1动物大体观察显示:造模动物均出现口鼻耳缘发绀、点头呼吸、躁动等现象,显示造模成功。1.1.2肺组织病理切片HE染色显示:哮喘组豚鼠支气管周围组织结构不清,可见大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,气道平滑肌增厚,管腔狭窄,可见痰栓,肺泡壁增厚;与哮喘组相比,贴敷治疗组在炎症细胞浸润、支气管壁平滑肌增厚、肺泡壁水肿增厚等方面均有改善。1.2白芥子涂法穴位贴敷具有调节乙酰甲胆碱所致哮喘豚鼠气道高敏感性的作用1.2.1吸气阻力:哮喘组豚鼠相比正常组,在受到0.125、0.25、0.5mg/ml乙酰甲胆碱刺激时,吸气阻力平均值和吸气阻力平均值均明显升高,结果具有统计学意义(p<0.01);而贴敷组在受到0.125、0.25、0.5mg/ml乙酰甲胆碱刺激时,吸气阻力平均值和相比哮喘组均明显降低,结果具有统计学意义(p<0.01)。1.2.2呼气阻力:哮喘组豚鼠相比正常组,在受到0.25、0.5mg/ml乙酰甲胆碱刺激时,呼气阻力平均值和曲线下面积均明显升高,结果具有显著性差异(p<0.01);而贴敷组在受到0.25、0.5mg/ml乙酰甲胆碱给药时,呼气阻力平均值和曲线下面积相比哮喘组均明显降低,结果具有统计学意义(p<0.01)。1.2.3肺顺应性:哮喘组豚鼠相比正常组,在受到0.25、0.5mg/ml乙酰甲胆碱刺激时,肺顺应性平均值及其与时间积分明显降低,结果具有显著性差异(p<0.01);而贴敷组在受到0.25、0.5mg/ml乙酰甲胆碱刺激时,肺顺应性平均值及其与时间积分值相比哮喘组均明显降低,结果具有统计学意义(p<0.01)。1.2.4气道阻力峰持续时间:相比哮喘模型组,穴位贴敷组在0.125mg/ml处,气道阻力峰持续时间减少,结果具有显著性差异(p<0.05)。2.白芥子涂法穴位贴敷通过调控TGFβ/MAPK/MMPs通路保护过敏性哮喘豚鼠气道上皮屏障相关蛋白。2.1白芥子涂法穴位贴敷对肺组织中转化因子β表达量的影响:Western Blot法检测各实验组豚鼠肺组织中TGFβ相对表达量表达。结果显示模型组TGFβ/β相对表达量相对表达量相比正常组明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05);而贴敷组相对表达量相比模型组明显降低,结果具有显著性差异(p<0.05)。2.2磷酸化Western Blot法检测白芥子涂法穴位贴敷对肺组织中Erk1/2、p38磷酸化水平的影响:结果显示,模型组Erk1/2、p38 MAPK磷酸化水平相比正常组明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组相比模型组Erk1/2、p38 MAPK磷酸化水平明显降低,结果具有显著性差异(p<0.05)。2.3白芥子涂法穴位贴敷对肺组织中金属蛋白酶活性、金属蛋白酶9及其抑制因子的影响:2.3.1明胶酶谱法检测白芥子涂法穴位贴敷对肺组织中金属蛋白酶活性的影响:哮喘模型组MMP9和MMP2蛋白酶活性与正常组相比明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组相比模型组MMP9和MMP2蛋白酶活性明显下降,结果具有显著性差异(p<0.05)。2.3.2 Western Blot法检测白芥子涂法穴位贴敷对肺组织中MMP9、TIMP1含量的影响:结果显示,模型组MMP9相对表达相比正常组明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组MMP9相对表达量对比模型组明显降低,结果具有显著性差异(p<0.05)。模型组TIMP1相对表达量相比正常组明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组TIMP1相对表达量相比模型组平均值略有降低,但结果不具有显著性差异(p<0.05)。2.4白芥子涂法穴位贴敷对哮喘豚鼠肺组织中上皮粘附连接蛋白的影响:Western Blot法检测各实验组豚鼠肺组织中Pan-Cadherin相对表达量表达。结果显示,模型组Pan-Cadherin相对表达量相比正常组明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组Pan-Cadherin相对表达量相比模型组明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05)。3.白芥子涂法穴位贴敷调制脏腑-穴位间神经-免疫级联相关因子机制。3.1白芥子涂法穴位贴敷对豚鼠穴位皮肤的影响:3.1.1大体观察结果显示,经白芥子涂法穴位贴敷后,见皮肤略有发红、轻微肿胀反应,次日见贴敷部位被毛根脱落,至下次贴敷时,穴位贴敷处被毛已全部长出,但略短于周围,显示穴位贴敷对局部皮肤有刺激作用。3.1.2病理切片染色显示,正常组与哮喘组豚鼠在穴位皮肤病理切片表现在表皮层、真皮层和皮肤附属器方面无明显差异,表皮棘层和毛根结缔组织鞘由两到三层细胞组成,部分哮喘组切片见角质层脱落及皮脂腺略有增生;哮喘组豚鼠穴位皮肤可见表皮棘层和毛根结缔组织鞘增厚,棘层部分细胞核固缩消失,真皮中可见淋巴细胞、嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润。显示穴位贴敷后激起穴位局部皮肤的炎性反应。3.2穴位贴敷对脏腑与穴位皮肤NGF含量的影响:3.2.1白芥子涂法对肺组织内NGF、SP、TRPV1含量与定位的影响:3.2.1.1免疫荧光结果显示,正常组豚鼠肺组织中有微弱阳NGF或SP表达,气道内皮细胞中支气管周围组织中偶见阳性表达;哮喘模型组在细支气管部分气道上皮细胞、上皮下基质细胞和支气管周围组织中有强阳性NGF或SP信号,光密度指数值(IOD)与正常组相比明显升高,结果具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组阳性细胞主要集中于支气管周围组织中,在哮喘组中的气道上皮细胞的特征性强阳性表达几乎消失,NGF或SP荧光信号IOD值与模型组相比明显降低,结果具有显著性差异(p<0.05)。免疫组织化学结果显示,正常组豚鼠肺组织中有弱阳性TRPV1受体表达,分布于支气管上皮细胞、上皮下基质细胞细胞膜上;而哮喘模型气道上皮细胞管腔侧胞膜和支气管周围浸润的炎症细胞出现TRPV1强阳性表达,平均光密度值与正常组相比明显上升,具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组相比哮喘模型组,TRPV1受体表达下调,平均光密度值与模型组相比,具有显著性差异(p<0.05)。3.2.1.2免疫印迹法检测NGF和TRPV1肺内表达量:哮喘模型组豚鼠肺组织NGF相对表达含量相比正常组明显上升,结果具有显著性差异(p<0.05);而贴敷组豚鼠肺组织NGF相对表达量相比哮喘组平均值明显下降,结果具有显著性差异(p<0.05)。哮喘组豚鼠肺组织TRPV1相对表达量平均值较正常组略有上升,但结果无显著性差异(p<0.05);贴敷组豚鼠TRPV1受体相对含量与哮喘组相比明显下降,结果具有显著性差异(p<0.05)。3.2.2白芥子涂法穴位贴敷对豚鼠贴敷部位穴位皮肤内NGF、SP和TRPV1含量与定位的影响:免疫组织化学结果显示,正常组豚穴位皮肤中表皮棘层、毛根结缔组织鞘和真皮组织中部分细胞具有阳性NGF表达;而哮喘模穴位皮肤与正常组表达部位相似,近在部分毛根结缔组织鞘中观察到NGF阳性细胞有所减少,平均阳性区域面积率相比正常组略有降低,但组间比较不具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组与前两组表达部位相似,阳性面积随棘层及毛根结缔组织鞘层厚而扩大,同时真皮层内浸润的大部分炎性细胞均有NGF阳性表达,与哮喘组相比,阳性面积率明显增大,结果具有显著性差异(p<0.05)。正常组豚穴位皮肤中具有弱的阳性SP表达,主要存在于表皮棘层部分细胞、皮脂腺和毛根结缔组织鞘内侧;而哮喘模穴位皮肤与正常组表达部位相似,但各部位中阳性细胞占比略有增高,与正常组相比阳性区域面积率略有上升但无显著性差异(p<0.05)而阳性区域光密度值明显上升,具有显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组穴位皮肤中,不仅棘层、皮脂腺和毛根结缔组织鞘具有强阳性表达,且在真皮组织细胞中具有大量的细胞显示出SP阳性,与哮喘组相比,阳性面积率明显增大,结果具有显著性差异(p<0.05),阳性区域光密度与模型组相比,无显著差异(p<0.05)。正常组豚鼠皮肤组织内的棘层、毛根结缔组织鞘、皮脂腺及真皮层散在TRPV1弱阳性表达,阳性面积率为16.5%±1.1%;哮喘组豚鼠棘层、毛根结缔组织鞘、皮脂腺等处中TRPV1表达细胞数略减少,但毛根结缔组织鞘表达强度略增加,阳性面积率与正常组相比,无显著性差异(p<0.05);穴位贴敷组豚鼠不仅棘层和毛根结缔组织鞘处随贴敷刺激组织层厚阳性面积增大,另外真皮层内阳性细胞数量也有所增加,阳性面积率与哮喘组相比明显上升,结果具有显著性差异(p<0.05)。结论:1.白芥子涂法穴位贴敷对于过敏性哮喘豚鼠具有降低气道高敏感性的作用。2.白芥子涂法穴位贴敷能够通过抑制TGF-β及其下游的Erk1/2和p38 MAPK磷酸化减少基质金属蛋白酶的表达并抑制其酶活,并从而保护气道上皮屏障相关蛋白。其对气道高敏感性的调节作用可能与此有关。3.白芥子涂法穴位贴敷能够调控神经-炎症关键因子和受体在穴位脏腑之间的空间分布关系,从而刺激穴位,调节脏腑功能,起到抑制哮喘中气道高敏感性的作用。