脂肪酶(Triacylglycerol lipase, EC 3.1.1.3)能催化甘油三酯键的断裂,是一种广泛存在于生物体的水解酶。此外,脂肪酶还具有多种酶活性,具有多样性的催化功能,是一种优秀的生物催化剂。因此,脂肪酶广泛的应用于多种领域中。在动物体中,胰腺分泌脂肪酶用于消化食物中的脂肪。将脂肪酶作为一种饲料添加剂应用于动物饲养中具有广泛的应用前景,不仅可以弥补幼禽幼畜体内脂肪酶分泌不足,还可以消除植物性饲料原料中的脂质抗营养因子,缓解我国饲料资源的不足。目前工业用途的脂肪酶主要经微生物发酵制得,但微生物产的脂肪酶存在酶源范围大筛选工作困难,筛选出的菌株产酶水平较低,酶活性低,稳定性较差,其基因的加工、分泌和调控机制不清楚,产酶菌株在不同程度上存在着一定的致病性、毒性,对动物体存在潜在危害等缺点。本研究诣在通过基因工程等手段,将编码猪胰腺脂肪酶的cDNA克隆到微生物体内,诱导表达出动物源的脂肪酶,克服了微生物源脂肪酶的缺点,具有潜在的饲用安全性和广阔的应用前景。以猪新鲜胰腺为实验材料,用Trizol法提取胰腺总RNA,采用RT-PCR技术扩增出编码猪胰腺脂肪酶(PPL)基因的cDNA序列,将其与表达载体pPICZaA连接,得到重组表达载体pPICZaA-PPL,经PmeⅠ酶切线性化后,采用电穿孔法将线性重组质粒整合到毕赤酵母X-33染色体上,采用荧光定量PCR的方法筛选具有高mRNA表达水平的酵母转化子,并用BMGY进行摇瓶培养,用甲醇在醇氧化酶Ⅰ(AOX1)强启动子的控制下进行BMMY诱导,实现外源重组蛋白PPL在毕赤酵母中的表达。外源重组蛋白经亲和层析柱(Ni Sepharose High Performance)纯化后,SDS-PAGE检测显示蛋白质分子量约为60 kDa,与预期目的蛋白产物大小相一致,产量为42mg/L。平板法定性检测重组蛋白酶具有活性,说明重组猪胰腺脂肪酶基因在毕赤酵母中获得了成功的表达。