研究背景及目的:原发性肝细胞癌是目前临床上非常常见的恶性肿瘤之一，它的发病率和死亡率居全球前列。现在临床上治疗肝癌的方法主要是通过手术治疗、放射治疗、药物治疗等手段进行的多学科综合治疗的方式，但病人治疗后的效果不尽如人意，其主要原因是对该疾病的发病机制还缺乏全面的了解，所以探究肝癌发病机制显得尤为重要。目前，大部分对肝癌发病机制的研究主要集中在癌基因、抑癌基因、病毒相关基因等的突变或对相关信号通路的异常调控上，而对肝癌代谢重构与其发病的机制研究还比较少。在我们前期研究结果中，通过基因芯片和蛋白芯片数据发现肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor4α，HNF4α)在肝癌病人肝癌组织和癌栓组织中较癌旁组织表达明显下调，而磷酸戊糖途径上的限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenease，G6PD）则逐渐增加，两者的转录水平和蛋白水平表达呈现负相关。通过染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）实验，我们发现HNF4α和G6PD的启动子区域有结合。但HNF4α究竟是如何通过调控G6PD来影响肝癌的代谢以及在肝癌发生发展过程中的作用机制目前尚不清楚。所以，本课题旨在通过生物化学与分子生物学等技术手段来研究HNF4α是如何通过调控G6PD来影响肝癌的代谢重构。　　研究方法:通过配对肝癌病人组织的基因芯片和蛋白芯片分析，直接筛选参与糖中心代谢途径等转录水平发生4倍以上变化的代谢基因，并通过QPCR和Western-Blotting等实验加以验证，确定HNF4α和G6PD等关键基因介导肿瘤的代谢变化。通过Kaplan-Meier方法分析HNF4α和G6PD的表达水平与临床预后的关系。然后，基于基因序列比对的比较基因组学的生物信息学手段，分析预测基因HNF4α结合在G6PD的启动子区域，并通过ChIP实验验证。并以同时扰动HNF4α和G6PD的组合肝癌细胞系为基础，利用13C标记的稳定同位素示踪技术研究肿瘤细胞的糖代谢变化;利用CCK8增殖实验和Transwell迁移实验研究同时扰动HNF4α和G6PD对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响;利用酶活实验检测扰动HNF4α对G6PD酶活的影响;并通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)和免疫荧光(Immunofluorescence)技术，探究HNF4α是否与G6PD蛋白相互作用，进而影响G6PD酶活。通过构建免疫缺陷性裸鼠皮下荷瘤模型观察扰动HNF4α和G6PD对裸鼠体内荷瘤能力的影响。最后，寻找在肝癌中影响HNF4α表达的microRNA。　　研究结果:1.临床配对肝癌病人基因芯片和蛋白芯片数据表明，在肝癌发生发展的过程中HNF4α表达逐渐下降，而G6PD表达逐渐增加;通过临床相关性分析发现:HNF4α低表达组患者总体生存时间明显低于HNF4α高表达组;G6PD高表达组患者总体生存时间明显低于G6PD低表达组，同时HNF4α低表达但G6PD高表达组患者总体生存时间明显低于HNF4α高表达但G6PD低表达组患者总体生存时间。　　2.ChIP实验证明HNF4α结合在G6PD的启动子区域，HNF4α在转录水平调控G6PD;Co-IP和IF实验证明，HNF4α与G6PD的蛋白相互作用。　　3.过表达HNF4α并敲低G6PD显著降低了肝癌细胞糖代谢;而敲低HNF4α并过表达G6PD则增强了肝癌细胞糖代谢，这提示HNF4α则可以通过调控G6PD来影响肝癌细胞代谢重构。　　4.过表达HNF4α并敲低G6PD显著降低了肝癌细胞增殖和迁移能力;而敲低HNF4α并过表达G6PD则增强了肝癌细胞增殖和迁移能力。　　5.microRNA34a和microRNA24可以负调控HNF4α蛋白表达，但是只有microRNA34a才可以通过调控HNF4α表达来影响G6PD，从而影响肝癌细胞增殖和代谢。　　研究结论:HNF4α参与调控肝癌发生发展中的糖代谢重构，通过调控磷酸戊糖途径的关键酶基因G6PD可以调控肝癌细胞的代谢，因此会影响肝癌的增殖与迁移等诸多的生物学功能，从而在肝癌的发生和发展过程中发挥十分重要的作用。我们的研究从一个全新的角度揭示了肝细胞癌的发病分子机制，并为之后肝细胞癌的治疗与诊断提供新的思路。