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N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)在医药、化学领域中具有广泛的应用,是合成抗流感、抗粘附、治疗炎症和肿瘤等药物的重要前体。以酶或全细胞作为催化剂催化合成NeuAc是常用的生产方法。以N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)为底物通过N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶(GlcNAc 2-epimerase,AGE)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase,NanA)的双酶连续催化可以合成Neu5Ac,但转化率低是限制工业化生产的重要因素。因此,构建全细胞生物催化剂实现高底物转化率合成Neu5Ac具有重要研究意义和应用价值。本论文主要研究结果如下:(1)分别构建表达slr基因和nanA基因的重组质粒pET28a-slr和pET28a-nanA,其中slr基因来源集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803),并且根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化合成,然后分别转化入E.coli BL21(DE3)。偶联两株重组菌催化合成Neu5Ac并优化催化条件,细胞生物量比为1:1(AGE和NanA酶活比为4:1),以600 mmol·L-1GlcNAc和1600 mmol·L-1丙酮酸为底物,同时添加0.4%Triton X-100,反应60 h后产生236.9 mmol·L-1 Neu5Ac,GlcNAc转化率为39.5%,生产强度为1.22 g·L-1·h-1。(2)改造底物和产物的转运途径,改善细胞的催化性能。敲除E.coli BL21(DE3)的nagE和nanT基因,使Neu5Ac的胞外向胞内转运途径和GlcNAc的竞争途径受阻,以提高Neu5Ac的产量和GlcNAC的转化率。评价基因敲除对Neu5Ac合成能力的影响,偶联E.coli△NE/pET28a-slr和E.coli△NTE/p ET28a-nanA催化最高可产260.0 mmol·L-1Neu5Ac,GlcNAc转化率43.3%,生产强度为1.34 g·L-1·h-1。(3)构建串联表达AGE和NanA的操纵子,通过SDS-PAGE、酶活分析和催化效率评价等分析重组蛋白表达水平,进一步通过启动子替换获得共表达NanA和AGE的重组菌E.coli/pET28a-(T7-nanA)-(tac-slr),获得了两种酶表达比例协调的重组大肠杆菌。优化其全细胞生物催化的反应条件,提高NeuAc的合成效率,以600 mmol·L-1 GlcNAc和1600 mmol·L-1丙酮酸为底物,添加0.3%Triton X-100,反应48 h后产生298.8 mmol·L-1Neu5Ac,GlcNAc的转化率为49.8%,生产强度为1.93 g·L-1·h-1。(4)通过基因挖掘,将来源Staphylococcus hominis基因组中的shnal基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化合成,替换来源于E.coli K12基因组中的nanA基因,构建重组菌E.coli/pET28a-(T7-shnal)-(tac-slr)。以该重组菌为催化剂合成Neu5Ac,同时优化催化反应条件。以600 mmol·L-1 GlcNAc和1600 mmol·L-1丙酮酸为底物,同时添加0.2%Triton X-100,反应12 h后产生312.5 mmol·L-1 Neu5Ac,GlcNAc的转化率为52.1%,生产强度为8.10 g·L-1·h-1。(5)利用蛋白质工程(饱和突变)改造AGE,提高由GlcNAc合成N-乙酰甘露糖胺(N-acetylmannosamine,ManNAc)的催化效率。使用构建的新型生物催化剂E.coli△NTE/pET28a-(T7-shnal)-(tac-slrA)能够进一步提高Neu5Ac的合成效率,Neu5Ac的产量达到351.8 mmol·L-1,GlcNAc转化率达到58.6%,生产强度为9.12 g·L-1·h-1。(6)从反应转化液中分离得到Neu5Ac晶体,结晶回收率为72.5%。与Sigma公司的neu5ac相比,同样条件下的hplc图谱出峰时间一致。本论文通过多目标优化获得全细胞催化合成neu5ac的重组大肠杆菌,为工业化生产奠定了基础。