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益生菌主要通过细胞免疫和体液免疫途径改善动物机体的免疫功能,促进动物健康生长。枯草芽孢杆菌是一种可饲用益生菌,对增强机体免疫能力,活化免疫系统具有重要的作用。目前,关于可饲用型枯草芽孢杆菌调节机体免疫机制研究较少。因此,本试验旨在研究枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)不萌发芽孢和不生孢营养体对猪肺泡巨噬细胞(MΦ3D4/2)免疫功能的影响。从B.subtilis PY79基因组DNA中分别扩增cl W、ger D和spo0A上下游同源臂,以pshuttle F质粒为模板,扩增抗性基因spec,分别构建用于敲除B.subtilis PY79芽孢萌发基因cl W、ger D、cl W-ger D和生孢早期基因spo0A的重组整合载体p LTJ-9、p LTJ-12、p YGJ-6和p YGJ-8;分别将整合载体转入B.subtilis PY79化学感受态细胞,利用同源重组敲除B.subtilis PY79芽孢萌发基因cl W、ger D、cl W-ger D和生孢早期基因spo0A,筛选芽孢不萌发突变株B.subtilis cl W-、B.subtilis ger D-、B.subtilis cl W-ger D-和不生孢突变株B.subtilis spo0A-,提取基因组DNA进行PCR检测;结合革兰氏染色和萌发率检测,分别对构建的B.subtilis芽孢不萌发突变株和不生孢突变株进行萌发和生孢能力鉴定;以PBS和B.subtilis PY79为对照组,B.subtilis cl W-ger D-和B.subtilis spo0A-作为试验组,分别与猪肺泡巨噬细胞于37℃,5%CO2共培养12h后,收集培养上清,用ELISA试剂盒检测IL-1β,TNF-α、IL-10等免疫相关细胞因子表达水平。取得的主要研究结果如下:1.PCR检测结果表明,成功敲除了B.subtilis PY79萌发相关基因cl W、ger D和cl W-ger D及生孢早期基因spo0A,获得不萌发突变株B.subtilis cl W-、B.subtilis ger D-、B.subtilis cl W-ger D-和不生孢突变株B.subtilis spo0A-。2.萌发和生孢能力检测结果显示,3株不萌发突变株中B.subtilis cl W-ger D-完全丧失芽孢萌发能力,B.subtilis cl W-和B.subtilis ger D-仍具有一定程度的萌发能力;显微镜观察和生孢率检测表明不生孢突变株B.subtilis spo0A-丧失了生孢能力。3.与MΦ3D4/2共培养结果表明,B.subtilis cl W-ger D-极显著的促进了细胞因子IL-6和IL-1β的表达量(P<0.01)。LPS刺激后,B.subtilis突变株对巨噬细胞免疫因子表达均无显著性影响。因此,B.subtilis不萌发芽孢和B.subtilis营养体对MΦ3D4/2的细胞因子表达具有调节能力。