实验目的 本研究在前期对AD多年研究的基础之上，采用新的基因表达抑制工具——RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)技术，探讨RNAi技术在体外细胞特异性下调BACE1的效果，为利用RNAi技术靶向BACE1治疗AD研究的进一步开展提供重要资料。 材料与方法 1.采用体外转录法合成siRNA用于RNAi实验。体外转录的基本步骤是：设计合成T7启动子(18bp)及含目标基因和T7启动子反向互补序列的DNA寡核苷酸链，两者退火后形成双链DNA。然后，T7RNA聚合酶在T7启动子引导下，以目标基因DNA寡核苷酸链为模板转录生成单链RNA。用DNase-Ⅰ降解反应体系中的DNA，获得单链RNA。将两个反应体系中生成的正、负单链RNA退火获得siRNA。 2.以neuro-2a小鼠神经瘤细胞株为实验对象，将外源GFP质粒转染进neuro-2a细胞，采用不同siRNA剂量对其进行干扰。neuro-2a细胞是一种与原代神经元特性相似的细胞，更适合用于神经系统疾病的研究。实验设立了空白对照组、阴性对照组、不同剂量siGFP转染组(分别为50ng、150ng、250ng)、非特异性对照组，转染后在荧光显微镜下观察不同实验组GFP的表达情况。通过观察GFP的表达与抑制情况检测合成体外转录合成siRNA的有效性和特异性，并对neuro-2a细胞的转染特性进行评估，指导对转染体系进行优化。 3.采用体外转录合成的siRNA对neuro-2a细胞内源BACE1基因进行干扰。干扰分别从三个不同的位点进行，于干扰后24h、48h、72h提取细胞总RNA，采用realtime-PCR检测不同干扰位点BACE1mRNA的表达水平。 4.采用AmaxaNucleofectorTM技术对原代培养的皮质神经元进行转染，将外源GFP表达质粒和干扰GFP的siRNA转染进原代皮质神经元，成功探索出一种可有效转染原代神经元的方法。 结果 1.通过体外转录法合成出有效的siRNA。 2.外源GFP质粒可被有效的转染进neuro-2a内，并有效表达。GFP在细胞内的表达呈现一定的时效性，随转染后时间的延长呈现先逐渐增强然后又逐渐减弱的趋势，48h～60h时是观察荧光的较好时机。体外转录合成的siRNA可以有效的敲低GFP基因的表达，敲低的程度与siRNA的剂量有关。 3.体外转录合成的siRNA有效的抑制了neuro-2a细胞内源BACE1基因的表达。siRNA对BACE1的抑制效应与靶位点的选择及检测的时间有关，不同的干扰位点其抑制效果不同；干扰后选择不同的检测时间，检测到的RNAi抑制效果也不相同。 4.在AmaxaNucleofectorTM转染技术和转染体系下，原代神经元可以被有效转染并表现出明显的目的基因干扰现象，而且没有明显的神经毒性反应 结论 1.采用T7RNA聚合酶催化体外转录法合成siRNA。体外转录法是一种操作简单、成本低、效率高的siRNA的合成方法，本课题组在前人的研究之上，对此方法进行了改进，增加了siRNA的提纯步骤，祛出了大部分反应体系中的蛋白质等杂质，得到高纯度的siRNA，确保了进行RNA干扰研究对细胞或机体对导入siRNA的质量要求。这为大范围、高通量进行RNA干扰研究提供了一种理想的siRNA合成方法。 2.利用体外转录合成的siRNA，成功抑制了neuro-2a小鼠神经瘤细胞株外源GFP基因的表达。将外源GFP基因转染至体外培养的neuro-2a中并使其表达，同时将不同浓度的siGFP共同转染至neuro-2a中，并以siIRR做参照。GFP基因在细胞内的表达随转染后时间的增长呈现出一个先逐渐增高然后又逐渐降低的过程，GFP表达最强的时点为观察RNAi效果的最佳时刻。对GFP干扰的分析发现，siRNA不仅能特异、有效地降低外源目标基因的表达，而且随着siRNA量的增加，其干扰效果越来越明显。 3.利用体外转录合成的siRNA，成功抑制了neuro-2a小鼠神经瘤细胞株内源BACE1基因的表达，这种抑制作用呈现出位点效应和时间效应。不同的干扰位点，其干扰效果会有不同；另外，siRNA在细胞内发挥靶基因mRNA降解作用需要一定的时间，这主要与siRNA在细胞内形成RISC的时间及靶基因mRNA的代谢特性有关。此外，若一次转染后若停止继续添加siRNA，被敲低的靶基因mRNA水平还可逐渐恢复正常，因此，转染后选择合适的分析时间至关重要，过早或过晚分析都会影响对RNAi效果的准确评价。 4.探索出一套可有效转染原代培养皮质神经元的方法。经过一系列实验探索，发现通过AmaxaNucleofectorTM技术可以有效对原代培养皮质神经元进行转染，而且没有明显的神经毒性反应，从而为进一步利用原代神经元研究AD提供了良好的技术支持。