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背景与目的:长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)参与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)及冠心病(coronary artery disease,CAD)的诸多病理进程,但其具体作用机制尚不清楚。本课题组前期研究工作在93个CAD患者和48个健康对照的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)样本中进行了 lncRNA/mRNA表达谱分析,并在412例冠心病病例、295例健康对照中重复验证,最终鉴定出7个差异表达lncRNAs。lncRNA ENST00000444488.1就是其中一个冠心病差异表达lncRNA,可以作为诊断CAD的新的生物标志物。但ENST00000444488.1在AS及CAD发生中的作用尚不清楚,因此本研究的目的是探索其在AS及CAD发生中的作用机制。方法:1.应用 3’和 5’-RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)实验及 Sanger sequencing 获得 ENST00000444488.1 转录本全长序列,Northern blot 实验验证ENST00000444488.1 转录本的大小;应用 RNA FISH(fluorescence in situ hybridization,FISH)确定 ENST00000444488.1 在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中的亚细胞定位;应用PhyloCSF软件分析ENST00000444488.1 的保守性;应用 BLAST 软件预测 ENST00000444488.1 的蛋白编码能力,并应用体外转录-翻译实验证明其蛋白质编码能力。2.在VSMCs中,采用gain-of-function和loss-of-function策略,进行细胞增殖实验(CCK-8)和 Transwell 实验,分别研究 ENST00000444488.1 对 VSMCs 增殖、迁移表型的调控作用。3.运用RNA pull down及质谱分析筛选与ENST00000444488.1相互作用的结合蛋白,并应用Western blot进行验证;应用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNAbinding protein immunoprecipitation)实验验证细胞内 ENST00000444488.1 与结合蛋白的相互作用;应用免疫荧光技术确定ENST00000444488.1与其结合蛋白在VSMCs中的亚细胞共定位。4.应用Western blot、Transwell实验及F-actin荧光染色技术分别探究ENST00000444488.1与MYH9蛋白的相互作用对MHY9蛋白水平、VSMCs迁移、VSMCs F-actin骨架重排的影响。5.应用 CRISPR/Cas9 技术建立 VSMCs 特异性 lncRNA ENST00000444488.1 转基因小鼠。结果:1.ENST00000444488.1的基本生物学特征分析1)5’和 3’-RACE 实验及 Sanger sequencing 确定了 ENST00000444488.1 全长序列为 1279nt;Northern blot 实验结果显示 ENST00000444488.1 在 VSMCs 和人脐静脉内皮细胞(human umbical vein endothelial cells,HUVECs)中的转录本大小约为1200nt,与RACE获得的全长序列大小基本一致,ENST00000444488.1 在 VSMCs 中的表达水平高于 HUVECs;RNAFISH 结果表明ENST00000444488.1定位于VSMCs细胞质、细胞核,但主要定位于细胞质中。2)PhyloCSF软件分析结果表明ENST00000444488.1在100多种脊椎动物种属间具有较低的保守性,且不具有编码蛋白质的能力;BLAST软件比对结果表明不存在与ENST00000444488.1同源性多肽,不具有氨基酸编码的能力;体外转录-翻译实验结果表明,ENST00000444488.1在体外翻译的产物不存在蛋白编码产物。以上结果表明ENST00000444488.1不具有蛋白质编码能力,是一个真正的长链非编码RNA。2.ENST00000444488.1 调控 VSMCs 迁移1)CCK-8增殖实验结果表明,在VSMCs中过表达和敲低ENST00000444488.1基因表达均不影响细胞的增殖。2)Transwell实验结果表明,在VSMCs中过表达ENST00000444488.1显著地抑制细胞的迁移;而敲低ENST00000444488.1则显著地促进细胞的迁移。3)应用血小板起源性生长因子 BB(platelet derived growth factor BB,PDGFBB)处理VSMCs,ENST00000444488.1表达水平显著下降;过表达ENST00000444488.1可显著抑制PDGFBB诱导的VSMCs迁移,表明ENST00000444488.1 参与 PDGFBB 诱导的 VSMCs 迁移。3.ENST00000444488.1调控VSMCs迁移的分子机制研究1)ENST00000444488.1与MYH9蛋白相互作用:RNA pulldown、质谱分析及Western blot实验筛选、验证结果表明ENST00000444488.1与MYH9蛋白结合;RNA RIP实验进一步证实细胞内ENST00000444488.1与MYH9蛋白的相互作用;免疫荧光染色结果表明ENST00000444488.1与MYH9蛋白在VSMCs内的共定位。这些结果均表明ENST00000444488.1可与MYH9蛋白相互作用。2)ENST00000444488.1与MYH9蛋白相互作用影响MYH9蛋白水平:在VSMCs中过表达或敲低ENST00000444488.1不影响MYH9基因的mRNA表达水平;在VSMCs中过表达ENST00000444488.1显著地降低MYH9蛋白水平,而敲低ENST00000444488.1则显著上调MYH9蛋白水平,结果表明ENST00000444488.1通过与MYH9相互作用影响了 MYH9蛋白水平。后续实验正在探究ENST00000444488.1与MYH9的结合影响MYH9蛋白水平变化的分子机制。3)ENST00000444488.1与MYH9蛋白相互作用影响PDGFBB诱导的VSMCs迁移:在VSMCs中过表达MYH9基因显著促进细胞的迁移,而敲低内源MYH9基因表达水平可以显著抑制细胞的迁移,且敲低内源MYH9基因表达显著抑制PDGFBB所诱导的VSMCs迁移。细胞迁移回复实验结果表明,敲低MYH9基因显著地抑制敲低内源ENST00000444488.1表达所诱导的VSMCs迁移。4)ENST00000444488.1与MYH9蛋白的相互作用影响PDGFBB诱导的F-actin骨架重排:与迁移表型一致,VSMCs中敲低内源ENST00000444488.1基因表达显著增强F-actin骨架重排;而过表达ENST00000444488.1则显著抑制PDGFBB所诱导的F-actin骨架重排。骨架重排回复实验结果表明,敲低MYH9则显著抑制敲低ENST00000444488.1所诱导的VSMCs F-actin骨架重排。4.建立VSMCs特异性ENST00000444488.1转基因小鼠应用CRISPR/Cas9技术建立ENST00000444488.1转基因小鼠:已获得F1代fl/+小鼠。结论:1.冠心病差异表达lncRNA ENST00000444488.1的全长序列为1279nt,主要定位于细胞质;该基因在100种脊椎动物物种间保守性较低,不编码蛋白质,是一个真正意义的长链非编码RNA。2.ENST00000444488.1 调控 VSMCs 迁移而不影响其增殖,且 ENST00000444488.1参与调控PDGFBB诱导的VSMCs迁移。3.ENST00000444488.1可与MYH9蛋白相互作用,二者的相互作用影响MYH9蛋白水平、VSMCs F-actin骨架重排,进而影响VSMCs的迁移。