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研究目的吉兰—巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)是一种常见的急性周围神经自身免疫性疾病,其病理特征主要为周围神经脱髓鞘和炎性细胞浸润,临床以肢体对称性弛缓性瘫痪为主要特征。目前,GBS的治疗主要是静脉注射丙种球蛋白或血浆置换,虽能缩短病程,加快病情恢复,但仍有大约3%～10%的病死率,20%的患者遗留不同程度的残疾。因此,有必要寻找治疗GBS的新方法。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是一种重要的花生四烯酸类物质的代谢产物,具有很强的免疫活性,可以调节免疫细胞的发育、功能以及存活。前列腺素E2受体(E-prostanoid receptors, EPs)分为4个亚型,即EP1、EP2、EP3和EP4, PGE2通过EP4受体作用于T淋巴细胞和树突状细胞,促进Thl细胞的分化和Th17细胞的扩增。近年研究显示,PGE2-EP4信号在一些自身免疫性疾病中发挥着越来越重要的作用。实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)是由CD4+T细胞介导的周围神经自身免疫性脱髓鞘疾病,是研究GBS的经典动物模型。EAN以周围神经脱髓鞘和炎性细胞浸润为主要病变,促炎性细胞因子,如IFN-γ、IL-17、IL-12等在其发病机制中起关键作用。基于以往体内外研究证实的PGE2-EP4受体拮抗剂对免疫系统的作用,我们应用PGE2-EP4受体拮抗剂L161982分别对免疫阶段和发病阶段EAN大鼠进行干预,通过观察其对EAN大鼠的临床、病理以及免疫指标的影响,评价L161982对EAN大鼠的作用并探讨其可能的免疫机制。研究方法1.抗原提取：采用超速离心法自牛脊神经根提取周围神经髓磷脂(Bovine Peripheral nerve Myelin, BPM)。2.实验动物：7～8周龄雌性Lewis大鼠21只,体重150～170g,SPF级饲养。3.建立EAN模型及临床评分：Lewis大鼠经适应性饲养(SPF级)1周后,]0%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉。将200μL抗原乳剂(含BPM5mg、结核杆菌2mg、生理盐水100μL和不完全弗氏佐剂100μL)注入大鼠双侧后肢足垫皮下。免疫当天记为0天,于免疫前1天及免疫后每日进行临床评分,直至免疫后第16天。临床评分：0：正常；0.5：全尾肌张力下降；1.0：尾部肌肉瘫,松软拖地；1.5：轻微后肢无力,肌张力下降；2.0：明显后肢无力或轻度后肢瘫；2.5：中度后肢瘫；3.0：严重后肢瘫；4.0：严重四肢瘫。4.前列腺素E2-EP4受体拮抗剂(L161982)治疗：随机将大鼠分为治疗A组、治疗B组和对照组,每组各7只。治疗A组于免疫前1天至免疫后第8天(免疫阶段)每日腹腔注射L161982(5mg/kg),治疗B组于免疫后第5至16天(发病阶段)每日腹腔注射L161982(5mg/kg),对照组每日腹腔注射相同体积的L161982溶媒DMSO。5.组织病理学检查：于EAN大鼠疾病高峰期(免疫后第16天)处死大鼠,取其坐骨神经近脊髓段并固定于10%中性福尔马林中,石蜡包埋,4μm纵行切片。HE染色,观察大鼠坐骨神经中浸润的炎性细胞。6.免疫组化检查：大鼠坐骨神经石蜡切片,常规脱蜡至水,经抗原修复、阻断内源性过氧化物酶活性,滴加一抗(兔抗大鼠IFN-γ、IL-17)和二抗(辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体),DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。40倍物镜下采集图像,观察大鼠坐骨神经中细胞阳性表达,结果以细胞数/mm2组织表示。7.CCK8法测定体外淋巴细胞增殖无菌条件下取免疫后第16天EAN大鼠腹股沟、胭窝淋巴结制备淋巴细胞悬液,调整细胞密度为2×106/mL,接种到96孔板中,200μL/孔,分别加入10μL BPM、ConA和RPMI1640,培养72h,再加入CCK810μL/孔,培养4h后,酶标仪测定其光密度值(OD值)。8.统计学处理：应用SPSS18.0软件,数据以x±s表示。应用单因素方差分析进行组间比较,组间差异有统计学意义则用SNK法或Bonferroni法进行组间两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.L161982延迟EAN发病时间、降低EAN高峰期临床评分：所有Lewis大鼠均发生EAN,与对照组相比,治疗A组、治疗B组发病时间均明显延迟(P<0.05)；治疗A组较治疗B组发病时间延迟(P<0.05)。治疗A组疾病高峰期临床评分明显低于治疗B组和对照组(P<0.05),治疗B组疾病高峰期评分与对照组比较差异无统计学意义。2.L161982减少周围神经中炎性细胞浸润：与对照组比较,治疗A组和治疗B组疾病高峰期大鼠坐骨神经炎性细胞浸润数目均明显减少(P<0.05),治疗A组坐骨神经炎性细胞浸润数目较治疗B组减少(P<0.05)。3.L161982减少周围神经促炎性细胞因子的表达：治疗A组和治疗B组疾病高峰期大鼠坐骨神经IFN-γ、IL-17阳性细胞数目均较对照组明显减少(P<0.05),治疗A组大鼠坐骨神经IFN-γ、IL-17阳性细胞数目较治疗B组减少(P<0.05)。4.L161982抑制体外淋巴细胞增殖反应：于疾病高峰期检测EAN大鼠引流淋巴结淋巴细胞增殖反应,与对照组比较,治疗A组、治疗B组均能明显抑制BPM和ConA诱导的淋巴细胞增殖(P<0.05)。结论1.在EAN免疫阶段和发病阶段应用L161982治疗,可明显延迟EAN发病时间,降低高峰期临床评分,提示L161982对周围神经自身免疫性疾病有治疗作用。2.在EAN免疫阶段和发病阶段应用L161982治疗,可减少坐骨神经中炎性细胞浸润数目,降低坐骨神经炎性细胞因子IFN-γ、IL-17表达,抑制引流淋巴结淋巴细胞体外增殖,提示PGE2-EP4受体拮抗剂L161982可能通过抑制EAN大鼠自身反应性T淋巴细胞增殖和促炎性细胞因子过度表达,抑制细胞免疫反应。3.L161982降低坐骨神经炎性细胞因子IFN-γ、IL-17表达,表明PGE2-EP4受体拮抗剂非特异性作用于T细胞亚群。4.与发病阶段治疗组比较,免疫阶段治疗组能明显延迟EAN发病时间,降低疾病高峰期临床评分,提示免疫阶段应用PGE2-EP4受体拮抗剂L161982治疗效果要优于发病阶段。