壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基转化而来的一种阳离子多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性，可与带负电荷的DNA通过静电作用形成纳米级颗粒，可使DNA免受核酸酶的降解，作为一种具有潜力的基因载体材料，日益引起研究者广泛的关注。壳聚糖作为基因载体的主要缺陷是转基因效率比较低，所以研究者们试图通过修饰以增加壳聚糖的转基因效率。我们实验室的前期工作显示，采用精氨酸和十六烷基修饰壳聚糖，可以明显改善其转基因效率。但修饰后的壳聚糖和DNA形成的纳米粒子对免疫细胞的影响如何，目前还没有相关研究报道。 本研究选用壳聚糖基因纳米粒子(Chitosan—DNA nanoparticles，CGN)、精氨酸化壳聚糖基因纳米粒子(Arginine modified chitosan—DNA nanoparticles，ACGN)和十六烷基化壳聚糖基因纳米粒子(Hexadecylated modified chitosan—DNA nanoparticles，HCGN)，并就其对初始T细胞和人单核巨噬细胞系THP—1功能的影响进行了初步研究。研究内容主要分为五个部分： 1.制备去除内毒素的质粒DNA，壳聚糖及其上述两种修饰物与DNA按照N/P比4：1的比例采用复凝乳方法制备纳米粒子；采用粒度及zeta电位分析仪进行表征。结果：CNP、ANP和HNP的zeta电位分别为12.1—14.63 mV，粒径约为148.07—179.47 nm。 2.采用Ficoll密度梯度离心法和免疫磁珠分选法从人外周血中分离初始CD4+T细胞(CD4+Tn)。Transwell体系由24孔培养板和Transwell小室组成，小室底部为具有0.1μm微孔的聚碳酸酯膜。Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，初始CD4+T细胞于小室内培养，THP—1细胞于24孔培养板中培养。将上述三种材料与DNA形成的纳米粒子分别以5μg/ml的浓度(以DNA的含量为标准，后同)与THP—1细胞共孵育12 h、24 h、48 h后检测THP—1细胞上清中IL-12的浓度和初始CD4+T细胞上清中细胞因子IL—4、IFN—γ的浓度，以观测纳米粒子是否刺激初始CD4+T细胞分泌细胞因子的增加，从而判断纳米粒子刺激初始CD4+T细胞的分化方向。结果显示48h内不会引起初始CD4+T细胞上清中细胞因子IL—4、IFN—γ分泌增加，即不会引起初始CD4+T细胞的分化。 3.人初始CD4+T细胞与上述5μg/ml的三种纳米粒子共孵育，12小时、24小时和48小时以后分别取上清，离心，分别检测IL—4和IFN—γ的含量，结果显示壳聚糖及其衍生物的基因纳米粒子并未刺激初始CD4+T细胞这两种细胞因子的分泌增加，说明纳米粒子不会直接激活初始CD4+T细胞。 4.初始CD4+T细胞接种到一个24孔板中，细胞密度为1×105，每孔1 ml，设六组，每孔加入5 ng/ml的人重组细胞因子IL—4(R&D System3×104IU/μg)，另一24孔板设计同上，不同之处在于向初始CD4+T细胞培养基中加的细胞因子是人重组IFN—γ(R&D System2×104IU/μg)。结果显示，壳聚糖及其衍生物的基因纳米粒子不会影响人重组IL—4或IFN—γ刺激后的初始CD4+T细胞向Th1和Th2的分化。 5.采用荧光素异硫氰酸酯(FITC)荧光标记壳聚糖及精氨酸修饰的壳聚糖，标记后的壳聚糖与DNA制成基因纳米粒子，以3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml(以DNA量计)加入THP—1细胞中，24h后流式细胞仪检测THP—1的摄入率。结果显示THP—1细胞对纳米粒的摄入随着纳米粒的浓度的增加而增加，在同等浓度下，THP—1对CGN的摄入比ACGN高，可能因ACGN的亲水性比CGN高，从而减弱了免疫调理作用有关。 通过上述研究可以看出，CGN、ACGN和HCGN对T淋巴细胞分化均不产生明显影响作用。