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EF-handCa2+结合蛋白超家族几乎参与到细胞生命调节的每一个过程,它们在序列上是同源的,但在结构和功能上却展现出多样性。EF-hand结构域有多种排布形式,钙调素(CaM),肌钙蛋白C(TnC),以及人钙调素类似蛋白(hCLP)代表了经典的哑铃型结构,我们称之为DS(Dumb-bellShape)蛋白。而恢复蛋白(reeoverin),钙调蛋白磷酸酶B亚基(CNB),钙整合素结合蛋白1(CIB1),神经元cE2+感受器蛋白1(NCS1),钾通道相互作用蛋白(KChlPs),以及鸟苷酸环化酶激活蛋白(GCAPs),则代表了另一类紧密折叠的结构,我们称之为RB(ReeoverinBranch)蛋白。 在本研究中,我们对DS蛋白和RB蛋白进行了结构比对和分子动力学模拟,发现它们在结构上的差异导致了分子动力学上的差异,并总结了这种差异与这两类蛋白的功能有一定的联系:DS蛋白与靶蛋白作用的方式与它们柔性的中央螺旋密切相关,而RB蛋白与靶蛋白作用的方式与它们稳定的动力学性质密切相关。我们还通过蛋白全序列以及EF2-EF3区域的序列比对和进化树分析,发现EF2-EF3区域一些特定位点的残基,在两类蛋白中各自是保守的,但又区别于彼此:它们在RB蛋白中的疏水性普遍要高于在DS蛋白中的疏水性。这些残基在RB蛋白中多位于EF2-EF3接触的界面上,因此可能对两类蛋白的折叠有重要影响。之后我们通过对CaM和CNB进行反向折叠研究,来验证这些残基的重要性。我们基于CaM和CNB的野生型序列和突变型序列(关键位置的残基替换成对方的序列),分别以对方的结构为模板来折叠,构建了4个融合蛋白,然后对它们进行折叠评估和分子动力学模拟。结果表明无论是CaM还是CNB,以对方的结构为模板来折叠都是不合理的,它们在分子动力学模拟中都无法维持对方的构象;而将CaM和CNB关键位置的残基替换成对方的序列后,再以对方的结构为模板来折叠,就会获得与对方类似的特性,在分子动力学模拟中(一定程度上)维持对方的构象。由此验证了EF2-EF3区域这些特定位点的残基,的确对DS蛋白和RB蛋白的折叠有重要影响。 钙调蛋白磷酸酶(CN)是Ca2+/钙调素(CaM)依赖的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,由含有双金属活性中心的催化亚基A(CAN)和豆蔻酰化的调节亚基B(CNB)组成,参与了许多细胞进程和Ca2+依赖的信号通路。CAN由一个催化结构域和三个调节结构域--CNB结合结构域(BBH),CaM结合结构域(CBD)和自抑制区(AID)构成。95年和02年先后发表了4个CN全酶或CN全酶与免疫抑制剂复合物的晶体结构,在这些晶体结构中,除了一个覆盖在活性中心上的自抑制肽段以外,其他从CBD直到CNAC末端的完整结果都是缺失的。之后人们开展了很多针对CaM和CBD的研究,解出了CaM-CBD复合物的晶体结构,为一个X型的二聚体;之后又有SAXS(小角散射)和NMR(核磁共振)的证据表明,CaM-CBD复合物的二聚体在溶液中会发生结构域的交换,形成1:1的类似CaM-smMLCK(平滑肌肌球蛋白轻链激酶)复合物的,CaM与靶肽的经典结合模式。然而,从CaM-CBD复合物的结构中,我们并不能了解CaM与完整CN是如何作用的。Qin等构建了CaM.单链CN复合物的融合蛋白CBA,从N端至C端依次为CaM.10Glv-CNB一6Gly-CAN。CBA的酶活性、内源荧光光谱以及圆二色谱表明,其在功能上等同于受CaM激活的CN全酶。因此,对CBA晶体结构的研究,有望了使人们解CaM与完整CN的相互作用情况,以及CaM激活CN的分子机制。 在本文中,我们构建了CBA的剪切突变体CBA482来进行结晶实验。CBA482去掉了CAN的AID(457-482)之后的区域,不但和全长CBA一样保留了CBD以及AID这些与CaM激活CN密切相关的区域,还避免了483.511区域中的无序结构给结晶带来的困难。我们解出了一个分辨率为3.5A的CBA482的晶体结构,在晶体结构的一个对称单元内,含有4个CBA482分子。不幸的是,CaM相应位置上的电子云密度图相当杂乱,无法解析出CaM以及CAN与CaM相互作用区域的结构。但CBA482的AI片段以及活性中心附近的构象与天然CNlAUI相比,有明显的差异:在CBA482中,AI片段是解旋的,并且活性中心更加暴露于蛋白表面。由此我们为CaM激活CN的机制,提供了一个结构学基础:CaM的结合使AI片段的构象发生变化,导致了其与周围残基的相互作用改变,进而使活性中心暴露于蛋白表面,有利于底物的结合。我们还通过SAXS实验,估计了CaM在CBA482中的大致方位以及与CAN的相互作用情况。统计结果显示,CaM与CAN最有可能的作用方式,是以N末端和C末端从两侧包围住CBD,即类似CaM-smMLCK复合物的结合方式,这与前人的研究结果相符。