论文部分内容阅读
目的:造血干细胞是一群具有高度的自我复制及多项分化潜能的最原始的造血细胞。人类HOXB4基因编码一类具有同源盒DNA依赖的结构域核蛋白,在造血干细胞的自我更新和分化过程中起到重要的调控作用。如何在体外扩增造血干细胞,使其既能保留其自我更新的特征又可以向不同血细胞分化是目前研究的重点和难点,调控其增殖和分化的因素和机制尚不明了,本课题采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9在基因组水平对斑马鱼的hoxb4基因进行编辑,并对其进行阳性突变体的筛选,以期建立下调hoxb4基因的突变体斑马鱼模型,为进一步筛选其下游靶基因及探讨对造血系统的作用机制提供实验材料及理论依据。方法:根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长约20bp的g RNA,分别靶向Exon I的192#位点,244#位点及313#位点。化学合成g RNA(guide RNA)寡核苷酸序列,经过酶切克隆连入p T7-g RNA质粒中,构建g RNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的g RNA。将质粒p SP6-2s NLS-sp Cas9线性化后经体外转录得到Cas9的m RNA并进行添加A尾修饰,将以上靶位点的g RNA与Cas9的m RNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,提取靶序列基因组DNA,PCR扩增出靶序列并使用T7EI酶切测效,最后将PCR产物连入p MD19-T simple载体中,挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定,然后经Sanger测序检测突变类型。结果:1.hoxb4靶序列基因组DNA的核酸扩增产物经测序鉴定结果与预期相符;2.设计的敲除hoxb4靶点的g RNA寡核苷酸双链成功连入p T7-g RNA质粒中且经碱基序列鉴定与预期相符;3.靶向hoxb4基因一号外显子的313#位点的g RNA成功编辑斑马鱼hoxb4基因,经T7EI酶切检测其敲除效率高达26.5%;4.313#靶序列的核酸扩增产物成功连入p MD19-T simple载体中并经测序筛选得到4种阳性突变型;5.有30%的斑马鱼可看到心包增大、心腔壁变薄及血流减缓血细胞减少的表现。结论:1.作为同源盒基因的hoxb4基因其表达可能在一定程度上呈现功能冗余性,即一个基因的异常可以被另一个基因的功能来补偿而不致引发疾病;2.通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型,为HOXb4基因功能的研究提供可靠的基因敲除方法,为寻找其下游靶基因提供实验材料,为后期探讨其机制并进一步行体外扩增造血干细胞提供理论依据。