牙胚的发育是两种相邻组织—外胚上皮和神经嵴来源的间充质相互作用的结果，一些信号分子在牙胚发育过程中呈时空特异性表达，并相互作用，调控细胞的生长和分化，决定牙胚发育的进程。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、Hedgehog(Hh)、Wnt四种信号传导途径在这一过程中起着主要的调控作用，它们可以调节未分化的上皮和间充质细胞聚集、分化，启动牙胚发育的级联反应。牙胚发育是在复杂网络有序调控下的连续过程，网络中任何一个节点的改变都会影响网络功能，改变牙胚的正常发育。 Sonic hedgehog(Shh)是脊椎动物Hedgehog信号蛋白家族成员，是发育组织中重要的分泌性信号分子，在多器官系统的正常发育过程中起关键作用，转基因小鼠Shh无效突变导致器官发育障碍，造成胚胎死亡。Shh在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性，它可以通过自分泌和旁分泌作用于上皮组织和周围间充质，促进细胞增殖、分化，调控牙齿的形态发生。Shh在牙胚发育晚期以及在细胞分化中的作用还知之甚少。本课题采用免疫组化、细胞培养、基因重组、基因转染以及牙胚培养、反义核酸等技术方法研究Shh在牙胚发育以及细胞分化中的作用，为深入了解牙胚发育的分子机制以及对牙体组织疾病和损伤进行生物性防治提供理论依据。常圈早医大拳俘创七学位论文一sonic Hedgehog在牙胚发育中的表达 采用免疫组化方法对Shh在小鼠牙胚发育各阶段以及人牙胚发育晚期的表达进行检测。结果显示:在小鼠牙胚发育初期，口腔上皮增厚，向间充质内陷形成牙蕾，Shh在口腔上皮、牙上皮强阳性表达;在帽状期，Shh表达于成釉器的内外釉上皮以及口腔上皮;在钟状期，Shh在成釉细胞强阳性表达，成牙本质细胞弱表达。在人牙胚钟状期，Shh的表达位置与小鼠一致。Shh在成釉细胞强阳性表达，成牙本质细胞亦可见Shh阳性信号。而牙乳头细胞和中间层细胞无明显表达。结果表明Shh在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性，提示Shh参与牙胚形态的发生和牙冠模式的形成，可能参与调控细胞的分化。二、Shh对牙乳头细胞生物学活性的影响 首先我们根据GenBank登录的Shh序列设计引物，用RT-PCR技术从人牙胚组织扩增出长约1.4kbp的特异性片段，将扩增的基因片段插入克隆载体pMD18一T，转化大肠杆菌XL一10 Gold，挑选阳性克隆，提取质粒，通过限制性酶切进行鉴定并进行核昔酸序列测定，结果表明:成功克隆人牙胚组织Shh全编码区基因片段，序列与GenBank收录的Shh序列一致，再次说明Shh参与牙胚的发育过程。 构建真核表达载体pcnNA3一shh，LiporeetAMxNETM 2000脂质体法转染哺乳动物细胞COS7，经蛋白印迹检测证实体外成功表达Shh。酶消化法培养小鼠牙乳头间充质细胞，MTT法检测Shh对体外培养小鼠牙乳头细胞细胞增殖的影响，酶动力法检测ALPase活性变化。实验结果表明:Shh促进牙乳头细胞的增殖(P<0.05)，提示Shh通过受体Ptcl途径，促进细胞增殖，参与牙胚发育。同时，Shh可以刺激牙乳头细胞碱性磷酸酶活性增强(P<0.01)。Shh影响体外培养牙乳头细胞.细胞外基质的合成:免疫组化法及图像分析结果显示，Shh增加牙乳头细胞I型胶原的表达，短期刺激牙乳头细胞不表达DSP，提示Shh可能与其他生长因子萦曰早吸大拳俘士拳位论文协同作用，参与牙乳头细胞向成牙本质细胞的分化。三、Shh反义核酸对体外培养小鼠牙胚发育的影响 建立小鼠牙胚体外培养模型，采用反义核酸技术，用特异的与Shh mRNA互补的反义寡脱氧核昔酸(ODN)抑制体外培养小鼠牙胚中Shh的翻译，继而观察该抑制反应对牙胚生长及矿化的影响。实验共分为三组:反义ODN组;正义ODN组及空白对照组，核酸浓度为30 p mol/L。培养牙胚均取自胎龄为E17，sd昆明小鼠下领第一磨牙，利用简易Trowell支架，体外分别培养1 Od后，进行HE染色、von Kossa染色。蛋白印迹结果显示所应用的反义核酸对Shh具有良好的封闭效果，阻断了牙胚中Shh的表达。HE、von Kossa染色结果显示:培养1 od，s一onN组与空白对照牙胚进入钟状晚期，内釉细胞呈高柱状，核远离基底膜。牙尖及邻近部位大部分牙乳头细胞分化为高柱状的成牙本质细胞，并可见分泌的基质带;钙磷酸盐在成牙本质细胞与成釉细胞间的基质中沉积。同对照组牙胚相比，AS一ODN组牙胚培养10d，牙胚进入钟状期，但牙胚体积明显变小，牙尖形态发育不良，成牙本质细胞排列紊乱，但仍可见高柱状分泌期细胞;von Kossa染色未见明显钙磷酸盐沉积。本研究用直接的实验证据说明Shh反义核酸不仅可以减缓体外培养牙胚的发育，还可影响牙胚的矿化。该影响可能是通过对成牙本质细胞分泌功能的影响而造成的。 综上所述，Shh参与了牙胚发育、细胞分化以及矿化过程，它在牙胚发育过程中呈时空特异性表达，促进牙乳头细胞型I胶原的表达，阻断Shh功能导致牙胚发育及矿化异常。对Shh的深入研究帮助我们深入认识牙胚发育过程中分子事件的机理，为牙齿再生研究奠定理论基础。