杀念菌素/FR-008产自链霉菌FR-008(Streptomycessp.FR-008)或灰色链霉菌IMRU3570(StreptomycesgriseusIMRU3570)，是一种具有广谱抗真菌活性的七稀大环内酯类化合物。杀念菌素/FR-008复合物的原始组份主要包括FR-008-Ⅲ，-Ⅴ和-Ⅵ，而LC-MS以及NMR的证据显示组份FR-008-Ⅱ，-Ⅰ和-Ⅳ是由于原始组份分子结构C15-C19半缩醛键发生断裂而产生的衍生物。NMR结果确认三个原始组份的结构差异仅存在于糖苷配基亲水基团一侧：组份Ⅲ和Ⅴ在C-9位上携带羟基，而组份Ⅵ为C-9位亚甲基；组份Ⅲ和Ⅵ在C-3位上为酮基，而组份Ⅴ为C-3位羟基；此外，与存在于组份Ⅲ和Ⅴ上的C-5位亚甲基和C-13位羟基不同，组份Ⅵ所携带的C-5羟基和C-13位亚甲基不能与杀念菌素/FR-008聚酮链合成装配线上相应部分的功能域组成及排列相匹配，所以推测组份Ⅵ在聚酮延伸步骤16th-20th中经历了基团修饰功能域(KR，DH，ER)的非线性催化。根据杀念菌素/FR-008合成路径可以预测到：在聚酮延伸步骤18th中功能域DH18的不完全活性可以导致C-9位羟基或亚甲基的产生，而最后一步聚酮延伸步骤中功能域KR21的不完全活性则可以造成C-3位上酮基或羟基的生成；此外，存在于杀念菌素/FR-008基因簇中的fscO基因所编码的单加氧酶也可能在后修饰步骤中负责C-9位羟基的生成。 为了验证这些推论，首先对fscO基因进行了置换，结果发现fscO与杀念菌素/FR-008的生物合成途径没有关联。随后对DH18和KR21的活性位点进行定点突变后得到了惊喜的结果：突变DH18使得携带C-9位亚甲基的组份Ⅵ不再积累，而携带C-9位羟基的组份Ⅲ和Ⅴ仍正常积累；突变KR21使得携带C-3位羟基的组份Ⅴ不再积累，而携带C-3位酮基的组份Ⅲ和Ⅵ仍正常积累；同时突变DH18和KR21则导致组份Ⅴ和Ⅵ的积累同时丧失，而携带C-3位酮基和C-9位羟基的组份Ⅲ仍正常积累。至此，根据化学结构解析以及遗传突变结果可以断定三个杀念菌素/FR-008主要组份的结构分化主要是由DH18和KR21的非完全活性所导致。此外，抑菌活性实验显示组份Ⅲ的活性大于Ⅴ而与Ⅵ相当。 另外，组份Ⅲ的水溶性优于Ⅵ，所以相对于Ⅴ和Ⅵ，组份Ⅲ的药用价值更为显著。因此，定向积累组份Ⅲ的突变株ZYJ-6(DH18和KR21双突变)具有显著的应用价值。KR，DH和ER是负责聚酮链延伸过程中基团修饰的功能域，是聚酮产物碳链母环上功能基团多样性以及分子异构化的基础，有效地操控这些功能域的催化活性可创造出更多新结构衍生物，作为新药筛选的基础。 二型硫酯酶(TEⅡ)与一型硫脂酶(TEⅠ)的显著区别在于：前者作为一个单独的蛋白行使硫脂键水解功能，而后者作为聚酮合酶(PKS)或非核糖体聚肽合酶(NRPS)碳端的一个功能域行使催化活性。在PKS和NRPS的基因簇中广泛存在着TEⅡ编码基因。TEⅡ基因的缺失导致聚酮或聚肽的产量显著降低，从而预示TEⅡ与产物的合成效率相关。已有生化证据显示TEⅡ可以水解去除ACP或PCP上加载的不能被聚酮或聚肽链延伸所利用的底物。但是还没有令人信服的数据来确证TEⅡ在聚酮合成过程中的底物选择性，即TEⅡ选择性的水解清除不能被PKS脱羧聚合反应所利用的中间产物而不去水解破坏正常的PKS延伸单位。 作为典型的一型PKS合成途径，杀念菌素/FR-008合成基因簇中也存在TEⅡ编码基因fscTE。链霉菌FR-008拥有成熟的遗传操作工艺，可观的产素水平以及快速的生长特性，所以是研究PKS合成途径中TEⅡ功能的理想材料。首先发现对fscTE的同框缺失后杀念菌素/FR-008产量下降了约90％；用fscTE在组成型启动子(ermE*p)下回补该突变株后产素水平得到显著恢复(75％)；作为回补实验对照，活性位点突变后的fscTE(S129A)不能恢复产素水平，从而确认了FscTE的催化活性与杀念菌素/FR-008聚酮的合成效率密切相关。为了验证PKS途径中TEⅡ的底物特异性，在FscTE氮端加载组氨酸标记后在大肠杆菌中对其进行高表达并最终纯化得到了高纯度的FscTE重组蛋白。SNAC衍生物作为酰基化载体蛋白(ACP或PCP)的模拟物己被成功的应用于硫脂酶催化机理的研究中。在本实验中乙酸和丙酸的氮-乙酰半胱胺硫脂(SNAC)衍生物被用来模拟加载于ACP上的不能被聚酮延伸所利用的中间产物，而丙二酸和甲基丙二酸的SNAC衍生物被用来模拟加载于ACP上的正常的聚酮延伸单位。体外酶催化实验表明FscTE对乙酸和丙酸的硫脂键具有显著的水解活性，而对丙二酸和甲基丙二酸的硫脂键仅有痕量的水解活性。这间接的证明了TEⅡ选择性的水解清除加载于ACP上的不能被聚酮脱羧聚合延伸反应所利用的中间产物，而极少去干扰正常的延伸单位。为了更充分的确认这个结论，另一个PKS途径的TEⅡ，即来自泰勒菌素(tylosin)的TylO，也被高效表达并纯化后用来对以上SNAC底物作测试。结果表明：TylO与FscTE的底物特异性完全一致。此外，对氨基苯甲酸SNAC也被用来模拟加载于ACP上的杀念菌素/FR-008合成起始单位。结果FscTE对对氨基苯甲酸SNAC硫脂键仅有痕量的水解活性。这提示FscTE不干扰杀念菌素/FR-008聚酮合成的起始。 在链霉菌FR-008中导入额外拷贝的fscTE(在ermE*p启动下)并没有造成杀念菌素/FR-008产量的下降，从而在另一个角度暗示FscTE仅清除不能被延伸利用的中间物，而不干扰聚酮合成的正常进行。 目前普遍认为TEⅡ在PKS合成过程中不参与聚酮链的最终释放，即TEⅡ不能代替TEⅠ的角色而负责延伸链的最终释放，这主要是基于两点体外生化实验证据：(一)体外实验显示TEⅡ对长链聚酮硫脂键的水解活性很低；(二)大量的体外生化实验证明TEⅠ可以有效的水解长链聚酮化合物的硫脂键。但是尚未有遗传学证据来支持这一观点。于是，对杀念菌素/FR-008聚酮合酶FscF碳端所携带的TEⅠ功能域的活性位点进行了突变(S1887A和S1888A)，结果TEⅠ失去活性后导致杀念菌素/FR-008不再积累。这表明TEⅠ的催化活性对于杀念菌素/FR-008聚酮链的最终释放是必不可少的，TEⅡ无法替代TEⅠ的使命。 源自PKS和NRPS途径的TEⅡ在进化上的差别也在杀念菌素/FR-008合成系统中得到了体现。属于PKS系统的TEⅡ基因(tylO)可以部分的回补fscTE缺失突变株，而另外两个NRPS系统的TEⅡ基因(tycF和srfAD)不能回补该突变株。这很好的呼应了已报道的生化实验结果：即源自NRPS的TEⅡ只能识别PCP而不能作用于ACP，而源自PKS的TEⅡ可识别不同来源的ACP。此外，TylO能促进FR-008合成效率的证据与其体外试验底物选择特性的结果形成了很好的呼应，从而更为坚实的支持了这样一个命题：“TEⅡ选择性的清除错误的中间产物，从而确保了杀念菌素/FR-008聚酮合成的高效运行”。