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目的1.探究P2X3受体在大鼠腰椎间盘突出诱导的神经病理性疼痛中的作用;2.探讨H2S信号分子在调节L5/L6背根神经节P2X3受体表达和功能中的作用特征。方法1.采用200-220g SD雄性大鼠,取出自体尾椎的正常髓核组织,置于手术显露后的腰5,6左侧神经根处,建立腰椎间盘突出症动物模型(LDH)。分别在术前1天,术后3,7,14,21,28和35天运用VFF(Von Frey filaments)及双足平衡实验(Weight Bearing)的方法来评测SD大鼠的行为学疼痛阈值反应。2.运用逆行标记的荧光素(Dil)来标记支配后肢的L5/L6背根神经节(DRG)中、小神经元,运用钙成像方法研究腰椎间盘突出症(LDH)大鼠L5/L6 DRG神经元中ATP诱导的细胞内钙信号反应及神经元的兴奋性变化。3.运用Western Blotting方法检测LDH模型大鼠L5/L6 DRG神经元中内源性硫化氢合酶CBS和CSE以及嘌呤受体P2XRs的蛋白表达情况。4.运用免疫组织化学方法检测LDH大鼠L5/L6 DRG神经元中CBS和P2X3R蛋白共表达情况。结果1.自体尾椎髓核(NP)移植能够显著降低LDH模型大鼠后肢的机械性疼痛阈值,并且这一现象是与L5/L6 DRG神经元中硫化氢合酶CBS蛋白的表达上调相关联的。2.与假手术组(Sham)相比,LDH组增加了L5/L6背根神经节(DRG)中P2X3R的蛋白表达量,而P2X2R,P2X1R的蛋白表达量并没有发生变化。3.对LDH大鼠鞘内注射硫化氢合酶CBS抑制剂AOAA后,发现AOAA能够显著的翻转LDH大鼠的疼痛阈值,并呈现剂量和时间上的依赖性。而作为对照,AOAA并不能够对假手术组SD大鼠的疼痛阈值产生作用。4.对LDH大鼠鞘内注射P2X3R的选择性拮抗剂A-317491后,发现A-317491能够显著的翻转LDH大鼠的疼痛阈值,并呈现剂量和时间上的依赖性。5.运用免疫组化的实验方法检测后发现硫化氢合酶CBS与P2X3R在L5/L6神经元中能够共表达。而且运用Western Blotting的方法进行检测后发现,连续给予LDH大鼠AOAA能够显著翻转NP引起的L5/L6神经元中的P2X3R表达的上调。6.全细胞膜片钳记录显示,与Sham组相比,在LDH大鼠L5/L6 DRG上,NP能显著增强ATP诱导的细胞内钙信号。鞘内连续给与硫化氢合酶CBS抑制剂AOAA后可以抑制LDH大鼠中ATP诱导的钙信号变化。7.通过单次或连续给与LDH大鼠足趾注射硫化氢合酶CBS抑制剂AOAA后,发现AOAA不能够翻转LDH大鼠的疼痛阈值,而且运用Western Blotting的方法进行检测后发现,连续足趾给药后大鼠L5/L6神经元中P2X3R表达未发生变化。结论腰椎间盘突出症模型(LDH)中髓核(NP)激活了内源性硫化氢(H2S)合酶CBS表达的上调,通过大鼠DRG中初级感觉神经元,调节了L5/L6神经元中P2X3受体蛋白的表达,从而增加L5/L6神经元的兴奋性进而产生神经病理性疼痛;我们的研究结果表明,内源性硫化氢(H2S)合酶CBS表达的上调可能在LDH大鼠椎间盘源性疼痛过程中扮演着重要的角色。因此,本研究能够在一定程度上揭示根源性疼痛产生的分子机制,从而为神经病理性疼痛的治疗提供更为有效的治疗方案。