胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，具有早期诊断困难、病程短、进展快、病死率高的特点，中位生存期约为6个月，总体5年生存率低于5％。目前手术仍是根治胰腺癌的唯一手段，但由于胰腺癌早期症状不典型，确诊时大多数患者已属中晚期，手术切除率低，仅为5％～15％，因此局部或全身化疗仍是治疗胰腺癌的重要手段之一。吉西他滨是美国FDA批准的用于治疗进展期胰腺癌的一线用药，对胰腺癌单一或联合其它抗癌药物都取得很高的疗效。吉西他滨是一种新型的脱氧胞苷类似物，属嘧啶类抗代谢类药物，属细胞周期特异性抗肿瘤药，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，即S期细胞，具有抗瘤谱广、作用机制独特、与其他化疗药物无交叉耐药且毒性反应无叠加等特点。然而，吉西他滨缺乏组织特异性，全身毒副作用大；体内代谢迅速，血浆半衰期短；肿瘤耐药性等缺点。 近年来随着生物技术以及纳米技术的飞速发展，磁控纳米载药系统在肿瘤靶向治疗的应用得到了人们的广泛关注。磁控纳米载药系统是将化疗药物、磁性内核包入高分子材料制成的纳米球中，注入体内后，它在体外磁场的作用下滞留于靶区，平稳释放药物杀伤肿瘤细胞，同时降低药物的全身毒副作用，是一种新兴的肿瘤靶向治疗方法。然而，良好的生物相容性仍是纳米医用材料的必备条件。壳聚糖为天然碱性多糖，是甲壳素脱乙酰基的产物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在体内降解产物能完全被人体吸收，无毒副作用；而铁元素乃人体必须元素，少量应用对人体无毒害作用。目前连接药物与磁纳米粒的常用方法包括物理负载法、离子交联法以及化学键耦连法等，其中由于化学键耦联可使载药磁纳米粒更为稳定、更能适应不同环境的变化而得到大多数研究者的喜爱。本研究采用化学沉淀法，药物共价耦联于体系，粒径小，体系稳定，通过细胞的摄粒作用进入细胞内，可实现安全有效的胞内靶向药物治疗。 根据以上内容，本论文着眼于胰腺癌靶向治疗的需要，整合磁纳米技术及化疗技术，提出以下思路： 1、以羧甲基壳聚糖(carboxymethylated chitosan，CS)及纳米级Fe3O4为载体材料，以吉西他滨(Gemcitabine，Gem)为模型药物，采用化学沉淀法制备吉西他滨．羧甲基壳聚糖氧化铁纳米微球(Gemcitabine-carboxymethly-ehitosan magnetic nanoparticles，Gem-CCMN)。考察Gem-CCMN的形貌、粒径，测定载药量及包封率及体外药物释放情况。 2、采用四唑盐显色法(MTI法)检测Gem-CCMN对胰腺癌CAPAN-2体外增殖的抑制效应，流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞凋亡。 3、建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，考察Gem-CCMN协同外磁场对裸鼠移植瘤的体内抑瘤效应。 第一部分吉西他滨磁纳米微球的制备及结构与性能表征研究 目的： 制备Gem-CCMN及研究其纳米表征。 研究内容与方法： 本部分内容以CS及纳米级Fe3O4为载体材料，以Gem为模型药物，采用化学沉淀法制备Gem-CCMN，并通过扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)观察磁纳米粒形态，紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry，US)测定微球的载药量及包封率，体外考察Gem-CCMN在模拟血浆及溶酶体液条件下药物累积释放率。 结果： Gem-CCMN呈球形，大小较均匀，平均粒径为(50±4.6)nm，载药量为(17±2.1)％，包封率为(45±5.3)％；傅立叶变换红外光谱显示：Gem的氨基与磁性粒子表面的羧基之间形成稳定的肽键(-CONH-)；体外药物释放表明：Gem-CCMN血浆48h累积释放量仅22％，而拟溶酶体液条件下药物累计释放率可达82％。 结论： 以CS和纳米级Fe3O4为载体材料，采用化学沉淀法成功制备出Gem-CCMN，该微球粒径小，大小均一，具有较好的载药量和包封率。Gem-CCMN在血浆中较稳定，而在拟溶酶体液条件下，随着PH的降低、胰蛋白酶活性的增加，可加快Gem-CCMN中-CONH-的水解，促进微球药物的释放。 第二部分Gem-CCMN对人胰腺癌CAPAN-2的体外杀伤研究研究 目的： 考察Gem-CCMN的体外细胞毒性。 研究内容与方法： 采用MTT法测定Gem-CCMN对人胰腺癌细胞CAPAN-2的增殖抑制率，采用流式细胞术(FCM)检测CAPAN-2凋亡。 结果： Gem及Gem-CCMN均明显抑制CAPAN-2细胞的增殖，诱导细胞凋亡和坏死，但彼此无显著性差异(p>0.05)。而CCMN空载治疗组与NS治疗组无显著性差异(p>0.05)。 结论： Gem-CCMN能有效抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡及坏死；而空载磁纳米粒CCMN对细胞无杀伤作用，作为药物载体具有良好的生物相容性。 第三部分Gem—CCMN协同外磁场对荷人胰腺癌裸鼠的治疗效果研究 目的： 考察Gem．CCMN协同外磁场下对肿瘤的生长抑制。 研究内容与方法： 建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，于移植瘤部位施加恒定外磁场，采用尾静脉注射给药方式，通过绘制肿瘤生长曲线以及计算肿瘤质量抑制率，考察Gem-CCMN协同外磁场对移植瘤的治疗效果。 结果： Gem-CCMN协同磁场治疗组的抑瘤率为41.35％，明显高于其他治疗组(p<0.05)；Gem治疗组(20.5l％)与Gem-CCMN治疗组(18.91％)无显著性差异(p>0.05)。 结论： Gem-CCMN在协同磁场作用下，可有效靶向肿瘤，增强对移植瘤的杀伤效应。