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热激蛋白(Heatshockproteins,HSPs)是一组广泛存在于原核和真核细胞中的蛋白质。它们是一类可以调节应激反应并保护机体防止细胞损伤的功能相关蛋白质,在机体的应激反应中具有重要作用。热激蛋白按照分子量的大小,可以大致分为HSP110,HSP90,HSP70,HSP60,HSP40以及小分子量热激蛋白。其中HSP70是热激蛋白家族中最保守、最重要的一族,在细胞应激后反应最明显,对维持细胞结构的稳定和提高细胞对应激原的耐受性发挥重要作用。Cd2+,Cu2+,Zn2+这三种重金属是普遍存在的环境污染物,对人体和动物的一些主要器官造成损伤。HeLa细胞来自于宫颈癌细胞,并且增殖迅速,所以它们作为理想的细胞用于科学研究中。 本实验以HeLa细胞(子宫肿瘤细胞)为材料,采用不同浓度的Cd2+,Cu2+,Zn2+三种重金属物质诱导细胞,并利用免疫荧光染色(IFS),SDS-PAGE,Westernblotting和RT-PCR四种手段来研究重金属对HSP70表达的影响。获得主要结果如下: 1.RT-PCR法研究HSP70基因转录水平 HSPs的表达在受到热刺激或其他压力刺激下会显著升高。通过RT-PCR实验研究我们发现,经过50-100μMCd2+处理后的HeLa细胞,HSP70mRNA的转录水平随着金属浓度的增加而显著升高。与对照组相比,经过100-200μMCu2+和Zn2+处理后的细胞,其HSP70均显著表达,且Cu2+和Zn2+对HSP70mRNA的转录影响相当。在这三种重金属之中,Cd2+具有最大的毒害程度。 2.Westernblotting法研究HSP70蛋白表达水平 当Cd2+的浓度为0-100μM时,HSP70蛋白条带逐渐加深,浓度为200μM时,条带颜色变弱,有可能是因为过高的金属浓度破坏了HeLa细胞的新陈代谢,某些机制抑制了HSP70的合成。当细胞经过100μM和200μM的Zn2+和Cu2+处理时,HSP70的表达量增加,与金属的浓度成正比。 3.免疫荧光染色(IFS)法研究HSP70蛋白表达水平 与对照组相比较,当Cd2+浓度较低时(25μM),HSP70的表达水平无显著性差异(P>0.05),说明低浓度的Cd2+并不会对Hela细胞造成显著危害。随着Cd2+浓度的升高,HSP70的表达量也随之升高,HSP70表达水平呈现差异显著(P<0.01)。对于Cu2+和Zn2+诱导组,HSP70表达水平明显增加,且HSP70的产生量与金属离子的浓度呈正相关。总体来看,三种金属对HSP70表达的影响程度为Cd2+>Zn2+>Cu2+。 通过以上三个实验,希望建立一种更有效的检测HSPs的手段,用于以后的研究。