背景：近年来世界范围内极端气候事件频发,如严重冰雪灾害及反常高温暑热等。极端气候事件导致心血管疾病的病情加重,引起发病率和死亡率增高。针对寒冷与暑热刺激对心脏疾病产生的具体影响,及其在已有基础病变的心肌组织内所产生的具体作用,包括相关的细胞生物学、分子生物学机制,尚缺乏系统的研究报道。在寒冷及暑热环境下,患有心脏疾病个体的心脏功能恶化程度,心肌组织病变加重的具体病理学与解剖学参数,以及相关生化指标的变化,亦需要进行具体的量化分析。以便为明确寒冷及暑热刺激下心血管疾病的变化规律提供参考数据和资料。心肌细胞损伤可体现在许多方面,包括细胞结构完整性破坏、线粒体能量代谢障碍、细胞内活性氧自由基(ROS)爆发、钙离子超载以及细胞凋亡改变等。冷／热刺激所造成的心肌细胞损伤,可能在上述各个方面有所体现。对冷／热刺激所造成心肌细胞损伤的方式进行观察分析,有助于在细胞水平展现冷／热刺激加重心肌病变的特点及规律。心肌细胞凋亡是心肌损伤的重要病理进程之一。线粒体跨膜电位ΔΨm下降则是细胞凋亡级联反应过程中的起始事件。ΔΨm崩溃导致电子传递链中断,氧化磷酸化停止,最终改变细胞电化学氧化还原状态并引起细胞凋亡蛋白酶Caspase激活物释放,激活Caspase-9、Caspase-3导致细胞凋亡或死亡。关于冷／热刺激导致心肌细胞损伤是否与线粒体途径有关,需要研究证实。细胞内ROS爆发是心肌细胞损伤和凋亡的重要机制,而对于冷／热应激是否引起心肌细胞内ROS爆发,及其可能机制尚不明了。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶复合物是体内活性氧ROS的重要来源之一,NADPH由多个不同的亚单位组成。其中最主要的是nox-1、p22-phox。冷／热应激在心肌细胞中是否引起nox-1、p22-phox的表达变化,及其所提示的ROS激活程度,有待实验加以探讨。Bim是Bcl-2家族中只含BH3结构功能域(BH3-only)的重要促凋亡蛋白,广泛分布于机体各种组织,与细胞凋亡的调控功能有关。在不同的组织细胞,以及不同的凋亡诱导条件下,Bim蛋白表达的调节机制可能不同。目前,关于Bim蛋白在心肌细胞凋亡中所起到的作用尚报导不多。作为调节细胞凋亡的关键蛋白之一,Bim在冷／热刺激诱导的心肌细胞凋亡进程中,也极可能发挥着重要调控作用,并可能影响到心肌细胞结构完整性的维持、线粒体能量代谢、细胞内ROS的产生、钙离子超载等诸多方面。探究冷／热刺激下Bim介导心肌细胞损伤的机制,将对从凋亡角度深入认识冷／热刺激诱导心肌细胞损伤的具体机制,产生重要理论意义。Bim可能与多种经典的凋亡相关信号通路有着密切关联。明晰冷／热刺激下Bim介导的心肌细胞损伤的信号传导途径及关联,可能在分子生物学水平提示新颖而有效的治疗干预靶点。Bim对心肌细胞凋亡的调控可能涉及众多信号分子途径,包括PI3K/Akt/GSK-3β信号途径、ERK信号途径等。这些信号通路其是否参与调节冷／热刺激诱导心肌损伤,及其与Bim表达的关系,目前尚未见报道。故此,Bim蛋白在冷／热刺激诱导心肌损伤中的作用机制以及调节机制,以及Bim与PI3K/Akt/GSK-3β信号途径、ERK信号途径中的相互作用,立为本课题的研究内容。干细胞移植修复心肌损伤的效果,已经众多实验与临床研究证实。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)是目前常用于细胞移植治疗的组织工程种子细胞。BM-MSCs可能通过多种途径改善并恢复缺血梗死状态下的心肌功能。在极端气候条件下,对已有基础缺血病变的心肌组织预先行BM-MSCs移植干预,是否能够提升其对极端气候条件的耐受性,及其潜在的具体机制,尚未有研究涉及,也作为本研究探讨的内容之一。方法：在RXZ-300A型智能人工气候箱的基础上,建立模拟寒冷／暑热环境的模型装置。对兔心肌梗死动物模型进行寒冷／暑热干预。实验分组：Ⅰ、常温组(MI),Ⅱ、寒冷组(MI+Cold),Ⅲ、暑热组(MI+Heat)。标准化法测定心肌梗死面积变化情况；超声心动图测定心脏功能；生理记录仪测定血流动力学指标；梗死区心肌组织切片苏木精-伊红(HE)染色评价病理学改变；Real-time PCR法检测心肌组织内iNOS和eNOS mRNA表达水平；western blot检测梗死区心肌组织Bim蛋白的表达水平。同时,对大鼠心脏肥大模型进行寒冷／暑热干预。实验分组：Ⅰ、常温组(H)Ⅱ、寒冷组(H+Cold)Ⅲ、暑热组(H+Heat)。超声心动图测定寒冷／暑热干预后心脏功能与结构变化情况；多导生理记录仪测定血流动力学参数。建立心肌细胞冷／热干预模型。对体外培养的新生乳鼠心肌细胞进行冷／热刺激干预,同时结合Bim siRNA干扰。实验分组：Ⅰ、正常对照组(Control),Ⅱ、冷刺激组(Cold),Ⅲ、热刺激组(Heat),Ⅳ、Bim siRNA+冷刺激组(BimsiRNA+Cold),Ⅴ、Bim siRNA+热刺激组(Bim siRNA+Heat),Ⅵ、非编码siRNA+冷刺激组(Non-coding siRNA+Cold),Ⅶ、非编码siRNA+热刺激组(Non-coding siRNA+Heat)。检测心肌细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性；MTS法检测心肌细胞存活率；流式细胞仪检测心肌细胞内钙离子水平、ROS水平、线粒体膜电位水平；TUNEL法及AnnexinⅤPI荧光探针法检测心肌细胞凋亡情况；western blot检测心肌细胞中Bim蛋白的表达水平变化。对体外培养的新生乳鼠心肌细胞进行冷／热干预,同时结合Bim siRNA干扰。实验分组：Ⅰ、正常对照组(Control),Ⅱ、冷刺激组(Cold),Ⅲ、热刺激组(Heat),Ⅳ、Bim siRNA+冷刺激组(Bim siRNA+Cold),Ⅴ、Bim siRNA+热刺激组(Bim siRNA+Heat),Ⅵ、非编码siRNA+冷刺激组(Non-coding siRNA+Cold),Ⅶ、非编码siRNA+热刺激组(Non-coding siRNA+Heat)。Western blot检测Caspase-9、nox-1、p22-phox蛋白表达水平,以及ERK与磷酸化ERK、PI3K与磷酸化PI3K、GSK-3β与磷酸化GSK-3β蛋白的表达水平。对体外培养的新生乳鼠心肌细胞进行冷／热刺激,并结合ERK通路阻断剂PD98059、PI3K/Akt通路阻断剂LY294002干预。实验分组：Ⅰ、对照组(Control),Ⅱ、冷刺激组(Cold),Ⅲ、热刺激组(Heat),Ⅳ、冷刺激+LY294002组(Cold+LY294002),Ⅴ、热刺激+LY294002组(Heat+LY294002),Ⅵ、冷刺激+PD98059组(Cold+PD98059),Ⅶ、热刺激+PD98059组(Heat+PD98059)。Western blot检测Bim蛋白的表达水平。骨髓穿刺法获得兔骨髓液,体外分离培养骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)。建立兔心肌梗死模型,于梗死区域心肌组织内直接注射法进行自体干细胞移植。细胞移植后行寒冷／暑热干预。实验分组：Ⅰ、心梗+寒冷干预组(MIC),Ⅱ、心梗+暑热干预组(MIH),Ⅲ、心梗+细胞培养基注射(对照)+寒冷干预组(MIC+M),Ⅳ、心梗+细胞培养基注射(对照)+暑热干预组(MIH+M),Ⅴ、心梗+BM-MSCs移植+寒冷干预组(MIC+SCs),Ⅵ、心梗+BM-MSCs移植+暑热干预组(MIH+SCs)。标准化法测定心肌梗死面积；超声心动图检测心脏功能参数；western blot检测心肌组织内Bim蛋白表达水平变化。结果：心肌梗死动物模型接受寒冷／暑热干预后,寒冷组(MI+Cold)与暑热组(MI+Heat)的心肌梗死面积,较常温组(MI)均有扩大(p<0.01,MI:36.27±4.43%vs.MI+Cold:46.74±3.21%：MI+Heat:42.62±2.80%)；寒冷／暑热干预后,心肌梗死兔的左室舒张末径(LVEDD)与左室收缩末径(LVESD)较常温组增大；左室后壁厚度(LVWT)和收缩期室间隔厚度(IVST)较常温组减小；左室射血分数(LVEF)较常温组下降。寒冷／暑热组的左室收缩末压(LVESP)低于常温组；左室舒张末压(LVEDP)高于常温组；左室内压上升最大速率(+dp/dtmax)和左室内压下降最大速率(-dp/dtmax)皆较常温组明显降低。组织切片HE染色结果显示,寒冷组及暑热组的梗死部位心肌纤维组织增生,心肌细胞结构病理性改变均较常温组严重。寒冷／暑热干预后,寒冷刺激组的梗死心肌组织中iNOSmRNA表达水平约为无刺激心梗组的2倍；eNOS mRNA表达水平约为无刺激心梗组的60%。暑热刺激组的梗死心肌组织中iNOS mRNA表达水平约为无刺激心梗组的1.5倍；eNOS mRNA表达水平约为无刺激心梗组的40%。寒冷／暑热干预后,梗死区心肌组织中的Bim蛋白表达水平均增高(MI+Cold:0.59±0.07；MI+Heat:0.46±0.01;vs. MI:0.34±0.04, p<0.05)。心脏肥大动物模型接受寒冷／暑热干预后,寒冷组和暑热组的左室后壁舒张末期厚度(LVPWTd)、室间隔舒张末期厚度(IVSTd)、左室舒张末期内径(LVDd),较常温组均有增加,提示心脏肥大加重。寒冷组和暑热组的左心室收缩压(LVSP),左心室压力变化最大速率(±dp/dtmax),较常温组均有增加,提示由心脏肥大引起的心脏收缩反常及左心室内高压进一步恶化。冷／热刺激干预后,心肌细胞培养液中LDH活性明显增高(Cold:105.15±6.98 IU/L; Heat:96.49±5.94 IU/L vs. Control:41.09±4.59 IU/L, p<0.01)。针对Bim进行RNA干扰后再施加冷／热刺激干预,心肌细胞培养液中的LDH活性升高幅度较单纯冷／热刺激干预组有所下降(p<0.01,Bim siRNA+Cold:81.56±5.38 IU/L; Bim siRNA+Heat:62.79±3.90 IU/L)。冷／热刺激干预后,心肌细胞存活率显著下降(Cold:65.46±4.56%; Heat:68.56±3.92% vs. Control:90.13±5.01%, p<0.01)。针对Bim进行RNA干扰,冷刺激干预下心肌细胞存活率有所提升(p<0.01,BimsiRNA+Cold:80.65±3.05%),而对热刺激下心肌细胞存活率无明显影响(p>0.05，Bim siRNA+Heat:76.37±5.61%)。冷/热刺激干预后,心肌细胞内钙离子聚积加重(Cold:625±27 nmol/L; Heat:588±49 nmol/L vs. Control:361±52 nmol/L,p<0.01)。针对Bim进行RNA干扰下调,于冷/热干预下都能缓解心肌细胞内钙离子水平的增高(p<0.01, Bim siRNA+Cold:619±33 nmol/L; Bim siRNA+Heat: 591±61 nmol/L)。冷/热刺激干预后,心肌细胞内活性氧水平明显升高(Cold: 10.8±0.85;Heat:9.92±0.93 vs. Control:3.61±0.71, p<0.01)。接受Bim RNA干扰的实验组心肌细胞内活性氧水平较单纯冷/热刺激干预组明显下降(p<0.01,BimsiRNA+Cold:4.82±0.48; Bim siRNA+Heat:4.80±0.51)。心肌细胞线粒体膜电位ΔΨm水平流式细胞仪检测结果显示：冷/热刺激干预后,心肌细胞线粒体膜电位ΔΨm水平明显降低(Cold51.32±5.57；Heat: 47.18±5.11 vs.Control:83.29±7.20, p<0.01)。RNA干扰下调Bim的实验组心肌细胞线粒体膜电位ΔΨm水平,较单纯冷/热刺激干预组的下降幅度明显减小(p<0.05, Bim siRNA+Cold:69.26±7.13; Bim siRNA+Heat:70.08±6.56)。心肌细胞线粒体膜电位荧光显微镜检测结果显示：冷/热刺激干预组心肌细胞的绿色荧光强于对照组,而红色荧光则减弱,表明线粒体跨膜电位受到破坏。Bim RNA干扰预处理后,心肌细胞绿色荧光强度减弱,红色荧光有所增强,提示通过RNA干扰下调Bim后,可减轻冷/热刺激所带来的心肌细胞线粒体ΔΨm下降。TUNEL检测和流式细胞仪AnnexinⅤPI检测结果均显示,冷/热刺激使心肌细胞凋亡率明显上升,而通过RNA干扰下调Bim后,可减轻冷/热刺激所造成的心肌细胞凋亡程度。冷/热刺激干预后,心肌细胞内Bim蛋白表达水平明显升高(Cold:1.14±0.08; Heat:1.05±0.08 vs. Control:0.20±0.03, p<0.01)。RNA干扰下调Bim的实验组心肌细胞Bim蛋白表达水平较单纯冷/热刺激干预组显著下降(p<0.01,BimsiRNA+Cold:0.47±0.05;Bim siRNA+Heat:0.32±0.05)。冷/热刺激干预后,心肌细胞Caspase-9蛋白表达水平显著上升(Cold: 1.05±0.09;Heat:1.38±0.13 vs.Control:0.11±0.01, p＜0.01)。针对Bim进行RNA干扰,则冷/热刺激干预下心肌细胞内升高的Caspase-9表达有所降低(p<0.01,BimsiRNA+Cold:0.22±0.01; Bim siRNA+Heat:0.32±0.01)。冷/热刺激干预后,心肌细胞nox-1蛋白表达水平有所上升(Cold:1.05±0.09; Heat:1.38±0.13 vs. Control:0.11±0.01,p<0.01)。针对Bim进行RNA干扰,热刺激干预下心肌细胞内升高的nox-1表达有所降低(p<0.01,Bim siRNA+Heat:0.32±0.01 vs. Heat:1.04±0.01)。冷／热刺激干预后,心肌细胞p22-phox蛋白表达增强(Cold:1.35±0.06; Heat: 1.58±0.03 vs. Control:0.39±0.01, p<0.01)。RNA干扰下调Bim后,可缓解冷／热刺激造成的心肌细胞内p22-phox高表达(p<0.01,Bim siRNA+Cold:0.87±0.03; Bim siRNA+Heat:1.05±0.06)。冷／热干预刺激后,ERK5和p-ERK5蛋白表达均增高。通过Bim siRNA下调Bim表达后,冷刺激组心肌细胞内ERK5和p-ERK5蛋白表达均有所下降；热刺激组心肌细胞内ERK5无明显变化,但p-ERK5的表达下降。冷／热干预刺激后,心肌细胞内PI3K与p-PI3K蛋白表达略有增高趋势,但未观察到有统计学意义的改变(p>0.05)。通过Bim siRNA下调Bim后,冷／热刺激组心肌细胞内PI3K与p-PI3K蛋白表达亦无明显变化(p>0.05)。冷／热干预刺激后,未观察到心肌细胞内GSK-3β蛋白表达水平有统计学意义的改变(p>0.05)。通过BimsiRNA下调Bim后,冷／热刺激组心肌细胞内GSK-3β蛋白表达亦无明显变化。冷热干预刺激后,心肌细胞内p-GSK-3β蛋白水平均增高(p<0.01)。通过BimsiRNA下调Bim后,冷／热刺激组p-GSK-3β蛋白水平有所下降(p<0.01,Cold：1.15±0.06 vs. Bim siRNA+Cold:0.89±0.06; Heat:1.05±0.09 vs. Bim siRNA+Heat: 0.83±0.03).LY294002干预对冷／热刺激下心肌细胞内Bim蛋白表达水平无明显影响。PD98059干预在冷刺激组使Bim蛋白表达有所增高(p<0.05,Cold：0.57±0.03 vs.Cold+PD98059:0.71±0.04)。PD98059干预在热刺激组使Bim蛋白表达显著增高(p<0.01, Heat:0.59±0.05 vs. Heat+PD98059:0.87±0.03)。预先干细胞移植,再接受寒冷／暑热刺激后的心梗面积参数,与未接受干细胞移植实验组接受寒冷／暑热刺激后的心梗面积参数之间无统计学差异。预先干细胞移植组,在寒冷／暑热干预下,左室射血分数均有改善。预先接受细胞移植,可减轻寒冷／暑热刺激造成的心肌细胞内凋亡蛋白Bim的表达增高(p<0.01,MIC+SCs:0.52±0.02 vs. MIC:0.83±0.02; MIH+SCs:0.76±0.01 vs. MIH:0.85±0.02).结论：寒冷／暑热干预可导致心肌梗死基础病变个体的梗死面积扩大,心脏收缩功能和舒张功能进一步恶化,并加重心肌组织坏死及凋亡；寒冷／暑热干预可通过诱导iNOS mRNA表达水平增高,eNOS mRNA表达水平降低,对心肌细胞产生损伤；寒冷／暑热干预可导致心脏肥大结构性病变和血流动力学紊乱程度加重；冷／热刺激通过引起心肌细胞内钙离子超载、ROS水平增高,以及线粒体膜电位降低,造成体外培养心肌细胞存活率下降、凋亡率上升；冷／热刺造成的损伤效应,与心肌细胞内促凋亡蛋白Bim的表达水平相关联。Bim可能介导了冷／热刺激对心肌细胞的损伤；Bim可能通过诱导Caspase-9表达增高,nox-1以及p22-phox蛋白合成增加,上调心肌细胞内ROS水平,介导冷／热刺激对心肌细胞的致凋亡效应；ERK5途径可反馈性抑制冷／热刺激造成的心肌细胞内促凋亡蛋白Bim的表达增高,发挥保护性作用。PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可能调控冷／热刺激造成的心肌细胞内促凋亡蛋白Bim表达；BM-MSCs移植可减轻冷／热刺激造成的心肌梗死基础病变个体的心功能恶化,并可能通过下调促凋亡蛋白Bim的表达发挥保护性作用。