鸡球虫病是规模化养鸡场最容易发生的寄生虫病，它的病原体为艾美耳属鸡球虫。鸡球虫病能够导致禽类的生长缓慢和饲料转化率降低，间接地引起养殖经济损失，如果严重时，则直接导致鸡只大量死亡，从而造成养殖户的重大经济损失。目前，有报道表明，每年因鸡球虫病给全世界的养殖业造成了约5亿英镑的巨大损失。当前在禽类的养殖业中主要还是依靠药物来预防控制鸡球虫病，但是球虫抗药性的问题日益突出。同时鸡体药物残留和药物价格过高等问题也促使人们去寻找新的方法来防治鸡球虫病。鸡球虫属于顶复器原虫，是专性细胞内寄生虫，生活史复杂，包括细胞内阶段和细胞外阶段，都需要入侵鸡肠道上皮细胞，在肠道细胞内生长发育繁殖。子孢子是鸡球虫入侵肠道细胞的第一个发育阶段，子孢子如何入侵，目前还不是很清楚。对子孢子阶段差异表达基因的研究，有助于了解鸡球虫的入侵和生长发育机制，可为新疫苗和新药物的研制提供新思路。本研究室前期利用抑制性消减杂交和cDNA微阵列技术筛选了柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子发育阶段的差异表达基因，获得了一些ESTs。本文即以致病力最强的柔嫩艾美耳球虫为研究对象，对获得的其中一个子孢子差异表达基因EST(克隆号：ZB7-B08，GenBank登陆号：ES351380.1)进行克隆、表达及分析，并对其功能、免疫保护力等进行了研究。　　 ⑴柔嫩艾美耳球虫新基因ZB7-B08 cDNA全长的克隆及分析。本研究选择柔嫩艾美耳球虫子孢子差异表达基因EST(克隆号：ZB7-B08)，通过RACE技术获得了该差异基因含一个完整开放阅读框的全长cDNA序列。在NCBI网站经同源性比对，发现该基因与犬新孢虫真核翻译起始因子3第7亚单位具有68％的相似性，推测该基因为柔嫩艾美耳球虫真核翻译起始因子3基因(eukaryotic initiation factor3，eIF3)。此外，利用生物信息学软件对该基因的跨膜结构、保守域、信号肽、抗原位点、以及疏水性等进行了预测，结果显示该基因开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)编码571个氨基酸，理论分子量约为65 KD，符合eIF3中d亚单位的命名规则，故命名该基因为EteIF3d，无跨膜结构，也无信号肽，但有大量抗原位点。利用Real-time PCR检测了该基因在柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的表达情况，结果显示，该基因在子孢子和第二代裂殖子阶段表达量相对较高，其中在第二代裂殖子阶段表达最高。　　 ⑵柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因的表达及抗原性验证。将目的基因EteIF3d连接到pET28b(+)原核表达载体上，成功构建重组表达质粒pET28b-EteIF3d后转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，经SDS-PAGE分析重组蛋白，分子量大约69KD，在加入IPTG诱导后6h即达到高峰，且重组蛋白主要以无活性的包涵体形式出现，用尿素将其变性后，过柱纯化获得重组蛋白His-EteIF3d，经Western-blot分析，结果表明重组蛋白EteIF3d具有良好的抗原性。为进一步对其功能进行研究，需要将其进行分泌表达，因此，将该基因连接到真核毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-EteIF3d后转化GS115酵母感受态细胞，利用甲醇作为唯一碳源，诱导表达后获得了有活性的可溶性蛋白，经Western-blot验证，毕赤酵母表达的EteIF3d蛋白具有良好的抗原性。　　 ⑶柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因与入侵发育相关分析。采用间接免疫荧光实验，将柔嫩艾美耳球虫子孢子体外接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)后，利用制备的兔抗EteIF3d多克隆抗体为一抗，分析EteIF3d在虫体不同发育阶段的定位、表达情况。结果显示，在子孢子入侵不同时间段，EteIF3d表达量逐渐呈增加趋势，并且刚入侵细胞时有向顶端聚集的趋势，随着子孢子的不断发育，表达量也呈上升趋势，到裂殖子阶段表达量达到最大。推测该基因在子孢子、裂殖子的发育过程中发挥一定作用，同时也可能和子孢子、裂殖子入侵肠道上皮细胞有一定关系。为了更进一步确认该蛋白与子孢子入侵的关系，随后又进行了该蛋白的体外抑制实验，将纯化后的兔抗EteIF3d多抗IgG以不同浓度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL)与子孢子孵育2h后接入DF-1细胞，采用流式细胞仪检测子孢子的入侵率。结果显示，随着抗体浓度的升高，子孢子侵入DF-1细胞的入侵率逐渐降低，说明该蛋白与子孢子入侵宿主细胞具有一定的关系。　　 ⑷EteIF3d基因编码蛋白对鸡球虫的免疫保护性实验。为了验证EteIF3d基因编码的蛋白是否对鸡球虫有较好的免疫保护效果，将重组蛋白His-EteIF3d分别以50μg/羽、100μg/羽分两组对雏鸡进行肌肉注射免疫，二免后7d用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊按1×104/羽给鸡灌服，并在不同的时间段采集鸡盲肠和脾脏检测不同的指标，最后综合分析评价该蛋白的免疫保护性效果。结果显示。在增重、卵囊减少率、病变记分等方面，免疫组都优于感染对照组，并且高剂量免疫组的效果明显更好；在体液免疫方面，His-EteIF3d免疫鸡后能产生特异性抗体，在整个免疫期及感染期，免疫组均有较高抗体存在于鸡体内，只是随时间推移，抗体浓度稍有变化，而且高剂量组产生的抗体效价也相对较高；细胞免疫方面，分析了鸡免疫后不同时间盲肠和脾脏中几种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-18以及IFN-γ)，的表达情况，结果显示，各种细胞因子在不同的免疫剂量、不同的免疫期、不同的感染期间都有各自的表达变化特点，为我们进一步了解细胞免疫在球虫入侵鸡体时发挥的作用奠定了基础。