从分离自海水、海泥及海洋生物内脏及海生植物表面的400余株酵母菌中分离到5株产蛋白酶的海洋酵母，能在酪蛋白双层平板上形成明显的透明圈，它们分别是HN2-3、N13d、N13C、Mb5和HN3-2。通过酵母鉴定的常规方法并结合分子生物学方法，鉴定出HN2-3、N13d、N13C与HN3-24株菌属于普鲁兰短梗霉（Aureobasidiumpullulans），Mb5菌株属于解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）。来自菌株HN2-3所产蛋白酶酶活性及酶解活性肽产物的ACE（AngiotensinI-converting enzyme）抑制活性最高。来自菌株HN2-3的蛋白酶命名为ALP2。利用层析柱Sephadex G-75与阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化了菌株HN2-3的胞外碱性蛋白酶ALP2，纯化2．34倍。通过SDS-PAGE凝胶电泳，得到的ALP2蛋白条带分子量为33．0 kDa，最适作用温度为52℃。Mn²⁺、Mg²⁺和Na⁺离子浓度在5 mM时对纯化蛋白酶酶活有激活作用，Zn²⁺、Ca²⁺、K⁺和Li⁺对酶活的影响不大；而当存在Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ag⁺、和Hg²⁺离子时，蛋白酶活明显降低。苯甲基磺酰氟（PMSF）强烈抑制蛋白ALP2的活性，乙二胺四乙酸（EDTA）与碘乙酸微弱抑制蛋白酶的活性。利用纯化的酶酶解砺虾蛋白，螺旋藻蛋白（Arthospiraplatensis），酵母N3C（Yarrowia，lipolytica）和YA03a（Hansenia sporauvarum）蛋白，来自蛎虾蛋白的水解物ACE抑制活性与抗氧化活性最高，分别达到88．3％与47．3％。这说明纯化的ALP2蛋白酶在食品和医药方面具有良好的前景。利用简并PCR、反向PCR与RT-PCR获得了蛋白酶ALP2基因的DNA序列与cDNA序列。基因ALP2的DNA序列为1354 bp，在NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）的登陆号为EU331441。ALP2基因的开放阅读框（ORF）1248 bp，在NCBI上的登陆号为EU224431，编码415个氨基酸，推导分子量为42．9 kDa。基因ALP2具有两个内含子，分别为54bp和52 bp。通过分子生物学软件分析，基因ALP2前18个氨基酸为信号肽序列，此基因编码的蛋白具有丝氨酸活性位点与组氨酸活性位点，等电点为6．44。利用质粒pINA1317对基因进行表达验证，发现转化子能在牛奶-PPB双层平板上形成明显的透明圈。转化子的发酵上清液的蛋白酶活性也进行了检测，结果说明克隆到的基因ALP2确实为蛋白酶基因，而且能在Y.lipolytica中进行表达，并分泌到细胞外。利用本实验室构建的表面展示质粒pINA1317-YICPW110对蛋白酶基因ALP2进行了表面展示，转化子能在牛奶双层平板上形成明显的透明圈。表面展示的蛋白酶酶解不同的蛋白源能够产生活性肽，发现酶解金黄色隐球酵母G7a（Cryptococcus aureus）的细胞蛋白所产活性肽的ACE抑制活性最高，酶解螺旋藻蛋白所产活性肽的抗氧化活性最高。这是首次关于利用表面展示蛋白酶进行活性肽的生产的报道。将表面展示的蛋白酶进行了酶学特性研究，发现与菌株HN2-3所产的野生型蛋白酶相比，最适作用温度有所降低，温度稳定性增强；另外发现表面展示的蛋白酶对金属离子的亲和力降低。