前言:自身免疫性甲状腺炎是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病,其中桥本甲状腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis,HT),又称桥本病,是甲状腺功能减退最重要的病因。虽然目前研究认为HT的病因还不十分明确,但随着近年来对于HT的研究逐渐增多,多项研究已证实在HT的发生发展过程中Th17细胞是不可或缺的。Th17细胞是一种主要分泌IL-17细胞因子的效应性T细胞。目前研究认为Th17细胞参与了包括多发硬化(MS)、类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病(IBD)等多种自身免疫性疾病的发生发展,研究已证实IL-23/IL-23R/p STAT3信号通路在Th17细胞分化和成熟过程中具有不可替代的作用。IL-23是IL-12家族的一员,主要是通过与细胞膜上的特异性受体IL-23R(mIL-23R)结合而发挥生物学效应,促进下游STAT3磷酸化(p STAT3)激活,诱导Th17细胞分化和成熟。有研究发现解离素-金属蛋白酶17(ADAM17)可促使细胞膜上IL-23R的胞外段脱落,抑制IL-23/IL-23R/p STAT3通路的信号传递。Micro RNAs(miRNAs)是一类新发现的长约22个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA,主要作用于基因转录后水平,通过对目标m RNA降解或转录后调节参与调控基因表达及一系列生理、病理过程。miR-326是众多miRNA中的一员,有多项研究发现miR-326参与MS、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、SLE、I型糖尿病(T1DM)等多种自身免疫性疾病,本课题组前期研究也发现在HT的动物模型NOD.H-2h4小鼠中miR-326显著高于对照组,提示miR-326可能与HT的发生密切相关,但目前尚缺乏miR-326在HT患者中的研究。本研究将分析miR-326在HT患者甲状腺组织及外周血中的水平,通过生物信息学分析预测了其可能的靶基因ADAM17,并探讨其可能的作用机制,为今后HT的诊断和治疗提供新的思路和治疗靶点。研究方法:本研究以HT患者为研究对象,收取因甲状腺癌或结节性甲状腺肿行甲状腺手术的患者的(对侧叶或结节旁)甲状腺组织,根据其甲状腺病理结果及甲状腺功能分为桥本病组(HT组,n=24)和非桥本病组(非HT组,n=29)。同时收取桥本病患者(n=31)及健康对照志愿者(n=23)的外周血,分离PBMC及血清和血浆。荧光定量PCR(RT-PCR)检测甲状腺组织和PBMC中miR-326及Th1/Th2/Th17/Treg细胞相关的细胞因子及其转录因子RNA水平的表达;流式细胞分析外周血中各T细胞亚群的细胞比例;使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清/血浆中IFN-γ和IL-17A的水平;同时我们将新鲜分离的PBMC进行体外Th17细胞极化培养,流式细胞分析极化培养后Th17细胞比例,比较HT患者和健康对照人群极化培养前后Th17细胞比例变化情况;此外我们在体外培养的PBMC中过表达miR-326,观察对Th17细胞的影响,进一步探讨其与Th17细胞的关系。为进一步探讨miR-326与Th17细胞的关系及其可能的作用机制,我们又收取了桥本病患者(n=27)及健康对照志愿者(n=32)的外周血,分离PBMC及血浆。流式细胞分析了外周血CD4+和CD8+细胞表面ADAM17/mIL-23R的表达及细胞中p STAT3的水平,同时IL-23刺激PBMC后流式细胞分析CD4+和CD8+细胞中p STAT3的水平,比较IL-23刺激前后各细胞中p STAT3的表达变化情况;ELISA方法检测血浆中可溶性IL-23R(s IL-23R)的水平;在体外培养的CD3+T细胞中特异性抑制ADAM17,观察ADAM17抑制后对mIL-23R的影响;此外HT和正常对照者来源的PBMC中分别进行沉默和过表达miR-326,双向观察干预miR-326后对ADAM17及下游mIL-23R的影响。结果:1.HT患者的甲状腺组织及PBMC中miR-326、IL-17A的m RNA水平均显著高于对照组(P<0.05),且miR-326与IL-17A的m RNA水平呈显著正相关(P<0.05),流式细胞分析结果显示HT患者外周血中Th17细胞比例显著高于正常对照组(P<0.05)。2.经体外Th17极化培养后,Th17细胞比例显著升高,且HT组Th17细胞比例升高倍数显著高于对照组(P<0.05)。3.体外过表达miR-326后,Th17细胞比例显著高于过表达对照组(P<0.05)。4.RT-PCR和Western Blot结果显示ADAM17的m RNA及蛋白表达在HT患者甲状腺组织和PBMC中均显著低于对照组(P<0.05),m RNA与蛋白表达呈明显正相关(P<0.05),且ADAM17的m RNA及蛋白表达与miR-326水平均呈显著负相关(P<0.05)。5.HT患者来源的PBMC体外沉默miR-326后,流式细胞分析发现ADAM17表达显著升高(P<0.05);而正常志愿者来源的PBMC经体外过表达miR-326后ADAM17表达显著降低(P<0.05)。流式细胞分析显示HT患者外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面ADAM17的表达均显著低于对照组(P<0.05)。6.流式细胞分析发现CD4+T细胞表面mIL-23R的表达显著高于对照组(P<0.05)。7.血浆中s IL-23R水平也显著低于对照组(P<0.05),且s IL-23R水平与ADAM17表达呈显著正相关(P<0.05)。8.IL-23刺激PBMC后,CD4+T细胞和CD8+T细胞中p STAT3水平较IL-23刺激前均显著升高,且HT患者中升高的程度显著高于对照组(P<0.05)。在体外培养的CD3+T细胞中抑制ADAM17后,mIL-23R表达显著升高(P<0.05)。9.HT患者来源的PBMC体外沉默miR-326后,CD4+T细胞中mIL-23R表达显著减少,Th17细胞比例也显著减少(P<0.05);而正常志愿者来源的PBMC经体外过表达miR-326后,mIL-23R表达显著升高,Th17细胞比例则显著增加(P<0.05)。结论:1.本研究中Th17细胞在HT患者中表达显著高于对照人群,这与前人研究结果相符。外周血PBMC经过Th17细胞极化培养后,Th17细胞比例显著增加,且HT组中Th17细胞比例增加倍数显著高于NC组,提示HT患者中Th17细胞的分化能力高于对照组。2.HT患者中存在miR-326的高表达,体外干预提示miR-326对Th17细胞具有显著的正向调节作用。3.HT患者中ADAM17表达显著低于对照组,体外培养的PBMC过表达或沉默miR-326后,ADAM17的表达显著减少或增加,提示miR-326对ADAM17具有负性调节作用。4.HT患者中mIL-23R表达显著高于对照组,而血浆中s IL-23R水平显著低于对照组,并与ADAM17呈显著正相关,ADAM17经TAPI抑制后mIL-23R表达显著升高,提示了ADAM17对mIL-23R的剪切作用。5.经IL-23刺激后,HT患者p STAT3水平增加倍数显著高于对照组,提示HT患者对IL-23的反应性高于对照组;且IL-23刺激后p STAT3水平与mIL-23R呈显著正相关,提示高水平的mIL-23R可能是HT患者对IL-23高反应性的原因之一。6.体外培养的PBMC过表达(或沉默)miR-326后,s IL-23R水平降低(或升高),IL-17表达增加(或减少),提示miR-326对Th17细胞的调节作用可能是通过负性调节ADAM17的表达,减少ADAM17对细胞膜IL-23R的剪切,间接上调HT患者中mIL-23R的水平,增强IL-23/IL-23R/p STAT3的信号传导来实现的。