目的：糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）常见而严重的慢性微血管并发症，已成为终末期肾衰竭（ESRD）的主要原因之一，因而，探索DN的发病机制及有效的防治措施是当今倍受肾病学者关注的课题。随着对肾小管间质病变在肾脏疾病进展与预后中作用的研究，发现肾小管间质病变在DN的发生发展中有着不可忽视的作用。研究DM小管间质病变发生、发展的机制，以及寻找干预治疗小管间质病变的措施具有重要意义。故本课题旨在研究高糖情况下肾小管间质改变并探讨干预措施。有关肾小管周围毛细血管（PTC）病变在肾间质纤维化中的作用，近年来才开始得到重视。具有强烈抑制血管生成的血小板反应蛋白1（TSP-1）与肾脏疾病关系越来越受到关注。近年研究表明在活化潜在转化生长因子β1（TGF-β1）中，TSP-1具有重要作用。从时间表达与空间分布看，TSP-1高表达与局部活化的TGF-β1表达相一致，推测其可能参与了肾脏纤维化进展。结缔组织生长因子（CTGF）是TGF-β的下游效应介质，在一些包括DN的病理状态下，特别是在伴有细胞增生和细胞外基质（ECM）合成增加的肾小球系膜区CTGFmRNA的表达明显增加。由此可以认为CTGF参与了肾纤维化的发生发展。骨形成蛋白-7（BMP-7）是骨形态发生蛋白（BMPs）家族的一员。近年来，动物实验发现，某些肾脏病的发生与BMP-7减少有关，而BMP-7治疗则可减轻肾脏损害，具有抗纤维化的作用。同时，它们在DN的发生和治疗中的作用也日益引起人们的关注。罗格列酮（RSG）是人工合成新型抗DM的噻唑烷二酮类（TZDs）药物，在提高胰岛素敏感性方面发挥关键性作用。TZDs还具有抗器官硬化和抗组织纤维化等作用。但在DN RSG是否通过影响TSP-1、BMP-7及CTGF的表达而抗纤维化，目前尚缺乏研究。本实验应用糖尿病大鼠模型和高糖培养的人的肾小管上皮细胞，观察不同时间点高糖培养的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）及实验性糖尿病大鼠肾小管间质TSP-1、CTGF、BMP-7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达情况，以及与间质细胞增殖、纤维连接蛋白（FN）沉积、间质纤维化等的关系，探讨TZDs类药物对DN的保护作用及其可能的与TSP-1、CTGF、BMP-7等相关的机制，为临床研究DN的发病机理及治疗措施提供理论依据。　　 方法：　　 1.糖尿病大鼠肾脏TSP-1、BMP-7的表达变化　　 选择体重180-200g健康雄性SD大鼠24只，随机分为二组，正常对照组（A组）和糖尿病组（B组），每组12只。B组大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素（STZ，60mg/kg，溶于0.1mol/L柠橼酸缓冲液，浓度为1％，pH值为4.5）制备糖尿病大鼠模型，A组只注射相同体积的枸橼酸缓冲液。72小时后尾静脉采血，用血糖仪测定全血血糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖为+++～++++时确定为糖尿病大鼠模型。分别于成模后4、8周各组任取6只测定大鼠血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿肌酐（Ucr）、肌酐清除率（Ccr）、尿n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性，24小时尿白蛋白排泄率（UAER）。对肾脏标本进行光镜HE、PAS及MASSON染色。免疫组化方法测定肾皮质TSP-1、BMP-7、CTGF、FN、α-SMA表达；各组大鼠肾皮质提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定大鼠肾皮质TSP-1、BMP-7、CTGFmRNA表达，Western blot法检测肾组织中TSP-1、BMP-7、CTGF的蛋白表达。　　 2.RSG对DM大鼠肾脏TSP-1、BMP-7表达影响的干预研究　　 选择体重180-200g雄性SD大鼠18只。所有动物随机分为三组，正常对照组（A组）、糖尿病组（B组）及糖尿病RSG治疗组（C组），每组6只。B组及C组大鼠腹腔单剂量注射STZ（60mg/kg），A组注射等量枸橼酸缓冲液。72小时后尾静脉采血，用血糖仪测定全血血糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖为+++～++++时确定为糖尿病大鼠。A组：实验过程中正常饲养，每日灌胃与治疗组等容积的自来水。B组：成模后从第二天开始每日灌胃与治疗组等容积的自来水。C组：成模后第二天开始灌胃罗格列酮30mg/kg，于实验第8周末，测定各组大鼠BG、Scr、Ucr、Ccr，尿NAG酶活性，24小时UAER。对肾脏标本进行光镜HE、PAS及MASSON染色。免疫组化方法测定肾皮质TSP-1、BMP-7、CTGF、FN、α-SMA表达；各组大鼠肾皮质提取总RNA，用RT-PCR方法测定大鼠肾皮质TSP-1、BMP-7、CTGFmRNA表达，Western blot法检测肾组织中TSP-1、BMP-7、CTGF的蛋白表达。　　 3.高糖对HK-2细胞TSP-1、BMP-7表达的影响　　 将细胞分为正常糖对照组（NG培养于含5.5mmol/LD-葡萄糖的DMEM培养基）、高糖组（HG培养于含25mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基）、高渗组（MG培养于含25mmol/L甘露醇），并于培养24、48、72小时后终止培养。用甲基噻唑基四唑（MTT）法观察不同时间（24、48、72h）高糖对细胞增殖状态的影响。RT-PCR检测各组HK-2 TSP-1、CTGF、BMP-7、α-SMA mRNA的表达，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞培养液上清液FN的含量，免疫细胞化学检测TSP-1、CTGF、BMP-7、FN、α-SMA，Western-blot法测定TSP-1、BMP-7、CTGF、α-SMA蛋白表达。　　 4.RSG对高糖环境下HK-2细胞TSP-1、BMP-7表达影响的干预研究　　 将细胞分为正常糖对照组（NG培养于含5.5mmol/Ld-葡萄糖的DMEM培养基）、高糖组（HG培养于含25mmol/l D-葡萄糖的DMEM培养基）、高渗组（MG培养于含25mmol/l甘露醇），RSG干预组（R5、R10、R20）为分别含RSG5、10、20umol/L的高糖DMEM培养基培养，用MTT法观察不同时间（24、48、72h） RSG对细胞增殖状态的影响。并于培养48小时后终止培养。RT-PCR检测各组HK-2细胞TSP-1、CTGF、BMP-7、α-SMA mRNA的表达， ELISA法检测细胞培养液上清液FN的含量，免疫细胞化学检测TSP-1、CTGF、BMP-7、FN、α-SMA，Western-blot测定TSP-1、BMP-7、CTGF、α-SMA蛋白表达。　　 结论：　　 1.TSP-1在正常大鼠肾间质有微量表达；随着DN病理损伤程度加重，TSP-1在肾小管上皮细胞、肾间质区表达增强，使PTC减少，导致慢性肾间质纤维化发生、发展。　　 2.在DN早期BMP-7水平的下降，提示BMP-7的降低可能参与了早期DN的发病，其在肾小管表达的变化提示DN早期可能已有肾小管间质受损。　　 3.伴随TSP-1表达的增加，BMP-7呈递减趋势，提示BMP-7可能在DN中具有与TSP-1相反的作用，即抑制肾脏纤维化的作用。　　 4.RSG能保护糖尿病大鼠的肾脏损伤。其可能机制包括减少TSP-1表达，抑制TGFβ-1下游效应因子CTGF的表达，增加抗纤维化抗炎作用的BMP-7表达等，延缓肾间质纤维化。　　 5.高糖能呈时间依赖性地诱导HKCs发生TEMT及合成CTGF及TSP-1，抑制BMP-7的表达。　　 6.通过体外实验，RSG可能通过减少肾小管上皮细胞TSP-1、CTGF表达，上调肾小管上皮细胞BMP-7表达，抑制DN肾间质纤维化的进展。