天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)提取自栝楼(Trichosantheskirilowii)的块根，属于Ⅰ型核糖体灭活蛋白，具有抑制HIV病毒、中期引产和调节免疫等多种生物学活性。特别是TCS有效抑制肿瘤细胞的药物学功能，在癌症治疗方面具有很高的应用价值和广阔的应用前景。由于天花粉蛋白对细胞的杀伤作用具有选择性，不同细胞对TCS的敏感性有很大差异，表明TCS分子表面可能存在与靶细胞相互作用的活性位点，然而，目前国内外有关TCS识别与结合靶细胞的位点及其特异性入胞的分子机制研究尚属空白。同时，TCS对肿瘤细胞的作用途径和抑制机理仍不十分清楚。这两点成为研究TCS抗肿瘤作用的核心问题。另一方面TCS对机体具有较强的免疫原性和毒副作用，极大地限制了TCS的临床应用。本文围绕上述两方面关键问题，通过对TCS分子结构以及氨基酸理化性质进行分析，选择和TCS结合与进入靶细胞以及免疫原性相关的可能位点，利用基因工程手段进行定点突变，进而采用细胞体系和非细胞体系以及实验动物模型，从TCS的结合与入胞作用入手，探索了TCS的特定氨基酸位点和抗肿瘤活性之间的关系，以及这些位点对动物的免疫原性和毒性之间的影响。为完善TCS抗肿瘤作用的理论体系，促进TCS的临床应用创造了条件。 为了提高选择突变位点的准确性和可靠性，作者借助生物信息学的系统软件，分析了TCS各个位点氨基酸残基的理化特性和空间构象，以高免疫原性、高亲水性、高亲溶液性并位于蛋白分子表面为标准，选择了两个潜在活性关键位点——第55位酪氨酸(Tyr)和第78位天冬氨酸(Asp)作为研究靶点，分别突变为甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)。通过重组PCR的方法，分别构建了两个单残基定点突变体Y55G、D78S和一个双位点突变体Y55G/D78S。同时，从栝楼基因组中分离得到一个新的核糖体灭活蛋白Trichomislin(TCM，GenBankaccessionno.AY584242)，TCM与TCS有13个氨基酸位点的差异。将野生型TCS(wtTCS)、Y55G、D78S、Y55G/D78S、TCM基因分别克隆至原核表达载体pT7-7中实现了高效表达，经过阳离子交换柱层析纯化得到五种表达蛋白。利用计算机模拟和圆二色性光谱法，对栝楼块根中提取的天然TCS(nTCS)和五种原核表达蛋白进行了一级结构和高级结构分析，突变体蛋白在溶液中保持了α+β的二级结构，六种蛋白的二级结构差异变化范围为1.4％-9.2％。 本文对TCS及其突变体蛋白在细胞体系和非细胞体系中的活性进行了分析。在细胞体系中，与TCS相比，突变体蛋白丧失了对其靶细胞(人绒毛膜上皮癌细胞，JAR)的生长抑制作用和诱导细胞凋亡的活性；而在非细胞体系下，突变体蛋白几乎完全保留了RNAN-糖苷酶活性、切割超螺旋DNA的酶活性和体外抑制蛋白质合成活性。而TCM具有与TCS类似的非细胞体系酶活性和对JAR细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。根据位点预测分析指标和上述突变体蛋白在细胞体系和非细胞体系中的表现结果，推测55位和78位氨基酸残基的改变主要影响了TCS跨膜入胞的过程。为此，将TCS及突变体蛋白用脂质体转染法导入JAR细胞，活性检测表明，三种突变体蛋白在转染的细胞内重新回复了对JAR细胞的生长抑制作用和诱导凋亡活性。进而利用流式细胞术和荧光显微镜测定法，对TCS与JAR细胞结合作用和跨膜入胞能力进行荧光分析，并通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的已知配体α-巨球蛋白的竞争性结合实验等更为直观的证据表明，三种突变体蛋白与JAR细胞膜受体蛋白的结合能力显著减弱，并且失去了通过LRP介导进入JAR细胞内部的能力。上述结果充分证明，TCS的55位Tyr和78位Asp残基是TCS与JAR细胞相互识别与结合并进入靶细胞的关键位点，对其中任何一个位点的突变导致TCS丧失进入细胞的能力，从而无法发挥杀伤肿瘤细胞的作用。这可能与上述位点氨基酸残基的改变，导致TCS识别并结合LRP的结构域发生了变化，影响了TCS与LRP的结合复合体入胞所需的精确的构象有关。对此假说的论证，尚需更多的实验证据。 通过对TCS及TCM在JAR细胞内部作用机制的进一步研究，本文阐明了TCS及TCM诱导的细胞凋亡过程是在蛋白跨膜进入细胞之后，经过线粒体依赖的、以细胞色素c释放为特征的内源途径进行的，且线粒体膜电势下降不明显。具体表现为TCS和TCM作用后的12小时内，JAR细胞胞质的细胞色素c含量增加，线粒体中的含量减少；同时，凋亡途径中的关键酶caspase-3活性显著上升；线粒体膜电势没有明显下降，说明细胞色素c不是通过线粒体通透性孔(PTP)释放的，可能与其他蛋白介导的通道相关。 为了深入开展TCS在肿瘤细胞内的分子定位以及作用靶位点等机理的研究，分别构建了哺乳动物细胞瞬时表达和诱导型稳定表达的平台，首次报道了TCS在哺乳动物细胞中的有效表达以及绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因在JAR细胞内的应用。TCS及其突变体在JAR细胞内源表达后对细胞的作用机制还有待进一步的实验分析。 TCS的毒副作用包括免疫原性和对动物内脏器官的损伤。以C57BL/6J小鼠为模型动物，用TCS和突变体蛋白每两周腹腔免疫一次，三次后分离小鼠血清和脾细胞，经ELISA和ELISPOT法检测，结果发现，相对于TCS，突变体蛋白致敏的小鼠其血清中的IgG与IgE抗体水平、脾细胞中分泌抗体的细胞数目和细胞分泌的抗体的能力都显著降低。表明TCS的55位和78位氨基酸位于抗原决定簇内，对这两个位点的突变影响了抗原决定簇的结构，导致TCS的免疫原性显著下降。同时，解剖学观察表明，突变体蛋白未造成小鼠内脏的明显损伤，突变体蛋白对小鼠的毒副作用显著降低。目前，我们利用所获得的突变体蛋白开展了导向药物的初步研究。将消除了自行入胞能力、同时免疫原性及毒副作用均明显减弱的TCS突变体与癌细胞单抗的单链可变区片段进行基因融合，构建了TCS-ScFv导向蛋白表达系统，为突变体蛋白发展成为临床药物奠定了基础。TCS-ScFv导向药物蛋白的表达及其功能研究工作正在进行中。