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背景及目的： 血脑屏障(The blood-brain barrier, BBB)将中枢神经系统(Central nervoussystem，CNS)与外周血分离开，严格把控化学物质、营养素、外周循环中的各种细胞、多肽以及其它多种物质进入脑实质，为神经元提供了一个特异的“环境”。血脑屏障的功能主要依赖于脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelialcells，BMECs)，脑微血管内皮细胞之间形成紧密连接(Tight junctions，TJs)，脑微血管内皮细胞的转胞吞作用降低，且一些具有代表性的细胞膜转运蛋白低表达。脑微血管内皮细胞间的紧密连接解聚可以导致跨细胞物质转运改变、血管生成异常、炎症反应以及脑灌注不足，也参与包括阿尔兹海默症(Alzheimersdisease，AD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)和多发性硬化(Multiple sclerosis)在内的疾病的发生和发展过程。 中枢神经中多种细胞在一些病生理条件下可产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), GM-CSF可以穿过血脑屏障。GM-CSF受体在脑实质中的分布具有广泛性，包括小胶质细胞、室管膜细胞、脉络丛细胞、神经元以及内皮细胞都表达GM-CSF受体。所以，有必要关注病生理状态下脑中GM-CSF的多种功能。有意思的是，GM-CSF可以促进人外周血单核细胞穿过血脑屏障，进入脑实质。其中部分机制在于GM-CSF抑制了脑微血管内皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1，ZO-1）和claudin-5的表达，从而增加了血脑屏障的通透性。 ZO-1是一种细胞质辅助蛋白，具有多种结构域，参与紧密连接的形成。ZO-1及其家族成员将claudin蛋白、occludins和连接黏附分子(Junction adhesionmolecules，JAMs)在内的跨膜蛋白和其它细胞质蛋白以及肌动蛋白微丝连接起来。一些研究报道了ZO-1表达的影响因素，部分揭示了ZO-1的转录机制。人脑微血管内皮细胞中，肿瘤坏死因子-α和白介素-6可以降低ZO-1的表达，而过表达内吞蛋白-1(Endophilin-1)则降低了ZO-1的表达。近来，Chen等人报道JunD是一种肠上皮细胞中ZO-1表达的生物抑制因子，而ZO-1在维持上皮细胞功能中起到关键作用。然而，各种病生理条件下ZO-1表达调控的分子机制并没有得到完全揭示。在本次研究中，我们利用多种体内和体外实验方法研究了GM-CSF抑制脑内皮细胞中ZO-1转录的分子机制。 实验方法： 一、在体实验中，GM-CSF对ZO-1表达的影响 1、小鼠侧脑室注射GM-CSF后48h，组织免疫荧光染色和Western blot检测纹状体微血管中ZO-1的表达变化。 二、脑微血管内皮细胞中介导GM-CSF抑制ZO-1表达的转录因子预测与验证。 1、构建包含不同ZO-1启动子片段的pGL3质粒，利用双荧光素酶报告系统筛选介导GM-CSF抑制ZO-1表达的转录因子的结合片段;利用在线软件Matinspector预测ZO-1启动子区片段-2787-2747上可能结合的转录因子。 2、RNA干扰Erg后，Real-time PCR、Westemblot以及细胞免疫荧光染色检测ERG和ZO-1的表达变化。 3、RNA干扰Nfatc1或Nfatc2后，Real-time PCR和Western blot检测NFATC1、NFATC2以及ZO-1的表达变化。 4、构建包含不同ZO-1启动子片段的pGL3质粒，利用双荧光素酶报告系统筛选与ERG共同促进ZO-1表达的转录因子的结合片段;利用在线软件Matinspector预测ZO-1启动子区片段-43--1上可能结合的转录因子。 5、RNA干扰c-Myc后，Real-time PCR、Western blot以及细胞免疫荧光染色检测c-Myc和ZO-1的表达变化。 三、人脑微血管内皮细胞中，转录因子ERG和c-MYC合作促进ZO-1转录 1、利用ChIP和Re-ChIP技术检测转录因子ERG和c-MYC是否共同结合ZO-1启动子区。 2、利用在线软件STRING(http://string-db.org/)分析ERG、c-MYC以及文献中报道的CREB1、JUND、MAX等分子之间是否存在相互作用。 四、脑微血管内皮细胞中，GM-CSF对miR-96/ERG轴的影响 1、利用Real-time PCR和Western blot分别检测GM-CSF对HBMECs中转录因子ERG表达的影响。 2、利用Real-time PCR和Western blot分别检测GM-CSF对HBMECs中转录因子c-MYC表达的影响。 3、利用在线软件microRNA.org预测抑制Erg表达的可能miRNAs。 4、利用Western blot检测高表达miR-33a、miR-30c、miR-30b和miR-19b2后，HBMECs中转录因子ERG的表达变化。 5、利用Western blot分别检测高表达或抑制miR-96后HBMECs中转录因子ERG和ZO-1的表达变化;构建包含野生型和突变型Erg3 UTR的质粒，双荧光素酶报告系统检测miR-96是否通过预测靶点抑制Erg的表达。 五、脑微血管内皮细胞中，GM-CSF发挥作用的信号通路 1、利用Real-time PCR检测HBMECs中GM-CSF对miR-96表达的影响;另外，利用Real-time PCR检测不同浓度的PI3K抑制剂BEZ235或AKT抑制剂MK-22062HCL作用下，GM-CSF对miR-96水平的影响。 2、利用Western blot和细胞免疫荧光染色检测抑制miR-96水平的同时，GM-CSF对转录因子ERG和ZO-1表达的影响。 六、在体实验中，验证miR-96介导GM-CSF抑制ZO-1的表达 1、小鼠侧脑室注射miR-96 antagomir-cy3后48 h，组织免疫荧光染色检测miR-96 antagomir-cy3在纹状体内的扩散情况。 2、小鼠侧脑室同时注射GM-CSF和miR-96 antagomir后48 h，组织免疫荧光染色和Western blot分别检测ZO-1的表达变化。 七、GM-CSF通过miR-96/ERG抑制BMECs中ZO-1表达机制的工作模式图。 1、绘制工作模式图。 实验结果： 一、在体实验中，GM-CSF对ZO-1表达的影响 1、组织免疫荧光染色和Western blot结果显示，小鼠侧脑室注射GM-CSF后48 h，纹状体微血管中ZO-1表达下降。 二、脑微血管内皮细胞中，参与GM-CSF抑制ZO-1表达的转录因子的预测与验证。 1、ZO-1启动子区-2787-2747是介导GM-CSF抑制ZO-1表达的转录因子的结合区域。在线软件Matinspector预测结果显示ZO-1启动子区-2787--2747结合的最可能转录因子为ERG、NFATC1和NFATC2。 2、Real-time PCR和Westem blot结果显示siErg-518和siErg-165可以显著抑制Erg和ZO-1 mRNA以及蛋白的表达;细胞免疫荧光染色结果显示siErg-165可以降低人脑微血管内皮细胞中ZO-1的表达。 3、Real-time PCR和Western blot结果显示siNfatc1-2543、siNfatc1-2441和siNfate1-2070均可显著抑制Nfatc mRNA的表达，但是不影响ZO-1 mRNA或蛋白的表达;同样，siNfatc2-2036、siNfatc2-1949和siNfatc2-1821均可显著抑制Nfatc2 mRNA的表达，但是不影响ZO-1 mRNA或蛋白的表达。 4、启动子区-43--1参与ZO-1转录调控。在线软件Matinspector预测结果显示ZO-1启动子区-43--1结合的最可能的转录因子为c-MYC。 5、Real-time PCR和Western blot结果显示si-c-Myc-587可显著降低c-Myc和ZO-1 mRNA以及蛋白的水平;细胞免疫荧光染色结果显示si-c-Myc-587可以降低人脑微血管内皮细胞中ZO-1的表达。 三、人脑微血管内皮细胞中，转录因子ERG和c-MYC合作促进ZO-1转录 1、ChIP结果显示转录因子ERG可以结合ZO-1启动子区序列，Re-ChiP结果显示ERG和c-MYC相互作用并结合ZO-1启动子区序列。 2、在线软件STRING(http://string-db.org/)分析结果显示ERG、c-MYC以及文献中报道的CREB1、JUND、MAX等分子之间可能形成复合体，共同参与ZO-1表达调控。 四、脑微血管内皮细胞中，GM-CSF对miR-96/ERG轴的影响 1、Real-time PCR结果显示，GM-CSF处理HBMECs后24h、48 h，Erg mRNA均显著下降;Western blot结果显示，GM-CSF处理HBMECs后48 h，ERG表达显著下降。 2、Real-time PCR和Western blot结果显示，GM-CSF处理HBMECs后，c-MycmRNA和蛋白均无显著变化。 3、在线软件microRNA.org预测抑制ERG表达的可能miRNAs，结果为miR-33a、miR-30c、miR-30b、miR-19b2和miR-96。 4、Western blot结果显示，HBMECs中高表达miR-33a、miR-30c、miR-30b和miR-19b2后，转录因子ERG和ZO-1的表达均无显著变化。 5、Western blot结果显示，HBMECs中高表达miR-96后，转录因子ERG和ZO-1表达均显著下降;抑制miR-96后，转录因子ERG蛋白表达上升，ZO-1表达显著上升;双荧光素酶报告系统结果显示miR-96通过结合预测到的Erg3UTR区抑制Erg的表达。 五、脑微血管内皮细胞中，GM-CSF发挥作用的信号通路 1、Real-time PCR结果显示，GM-CSF处理HBMECs后24h、48h后，miR-96表达均显著上升;PI3K抑制剂BEZ235和AKT抑制剂MK-22062HCL分别以浓度依赖性的方式降低miR-96的水平。 2、Western blot结果显示，GM-CSF和miR-96抑制剂同时处理HBMECs后，GM-CSF不能抑制ERG和ZO-1的表达;细胞免疫荧光染色结果显示，GM-CSF和miR-96抑制剂同时处理HBMECs后，GM-CSF不能抑制ZO-1的表达。 六、在体实验验证miR-96介导GM-CSF抑制ZO-1的表达 1、组织免疫荧光染色结果显示，小鼠侧脑室注射miR-96 antagomir-cy3后48 h，miR-96 antagomir-cy3可以扩散至纹状体以及纹状体中的微血管内。 2、组织免疫荧光染色和Western blot结果显示，小鼠侧脑室同时注射GM-CSF和miR-96 antagomir后48 h，GM-CSF不能抑制ZO-1的表达。 七、GM-CSF通过miR-96/ERG抑制BMECs中ZO-1表达机制的工作模式图。 1、脑微血管内皮细胞中，GM-CSF通过PI3K/AKT信号通路影响miR-96/ERG轴，进而抑制ZO-1的表达。 结论： 1.脑微血管内皮细胞中，GM-CSF通过miR-96/ERG轴抑制ZO-1的表达。 2.脑微血管内皮细胞中，miR-96可作为潜在的靶点，抑制GM-CSF引起的ZO-1表达下调。