研究背景和研究目的： 本论文旨在探讨PC-PLC和膜整连蛋白β4调节神经元存活与凋亡的作用及其作用机理，为阐明发育过程中神经细胞存活和凋亡的调控机制提供实验证据，同时为临床上治疗神经系统疾病奠定理论基础。 研究内容： 1.小鼠神经元细胞的分离、原代培养及鉴定。 2.利用PC-PLC的特异性抑制剂D609研究PC-PLC调节神经元存活的作用。 3.研究PC-PLC介导的神经元存活中相关的重要分子及作用机理。 4.利用RNAi技术阻断膜整连蛋白β4表达，研究其调节神经元存活与凋亡的作用。 5.研究膜整连蛋白β4介导神经元存活与凋亡中相关的重要分子及作用机理。 研究方法： 1.小鼠神经元分离、培养及鉴定： 1)神经元的分离和培养，参考Sunanda的方法[Sunanda et al，1998]。 2)免疫细胞化学法检测神经元标记物。 2.细胞存活率检测： 1)用MTT方法，检测细胞存活率。 2)用台盼蓝染色，检测细胞存活率。 3.细胞凋亡及坏死检测： 1)用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。 2)吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察，检测细胞核片断化。 3)使用TUNEL染色方法，检测细胞凋亡率。 4)通过分析LDH(乳酸脱氢酶)活性，检测细胞是否出现坏死。 4.PC-PLC活性检测：参考吴兴中等研究者的方法[Wu et al,1997]。 5.用RNAi技术干扰蛋白表达：利用化学合成的siRNA特异性阻断神经元中膜整连蛋白β4的表达。 6.ROS检测：利用荧光探针(DCHF)结合激光扫描共聚焦显微术检测其变化。 7.SOD活性检测：利用SOD检测试剂盒分析其活性变化。 8.NADPH氧化酶活性检测：参考Li的方法[Li et al，2002]。 9.细胞内蛋白水平及分布检测： 1)用免疫细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微术，检测Rb、膜整连蛋白β4的蛋白表达及分布。 2)用Western blot方法，进一步检测膜整连蛋白β4的表达。 研究结果： 1.成功分离、培养小鼠原代神经元选用E14胎鼠大脑组织为实验材料，分离得到原代神经元。通过倒置相差显微镜观察，细胞呈典型的神经元形态，并可形成神经网络连接(图1-1-1)。利用免疫细胞荧光染色，分别检测了NSE和GFAP的表达情况，绝大多数细胞NSE表达呈阳性，统计学分析显示98％的细胞为神经元(图1-1-2)。 2.D609抑制神经元的存活2.1 MTT法检测结果表明，2-8μg/ml的D609处理原代神经元8h后，细胞存活率明显下降，为68.78％-20.46％，且下降呈剂量依赖性(表1-2-1)。 2.2倒置相差显微镜观察显示，8μg/ml的D609处理神经元8h后，神经元出现明显的凋亡形态，胞体皱缩，胞浆内空泡明显，核固缩，折光性减弱，神经突起发生断裂或明显缩短，凋亡小体形成(图1-2-1)。 2.3吖啶橙染色激光扫描共聚焦显微镜观察显示，8μg/ml的D609处理神经元8h后，细胞呈现出典型的凋亡形态学特征，细胞核固缩、染色质凝集且边缘化明显、核碎裂，凋亡小体清晰可见(图1-2-2)。 3.PC-PLC调节神经元存活的分子机制3.1.对细胞中PC-PLC活性进行检测，发现原代培养的神经元细胞中存在两种类型的PC-PLC，钙离子依赖型PC-PLC和钙离子非依赖型PC-PLC。用8μg/ml的D609处理神经元8h后，两种类型的PC-PLC的酶活显著降低(p＜0.01，图1-3-1)。 3.2免疫细胞化学检测结果表明，用8μg/ml的D609处理细胞6h后，膜整连蛋白β4表达明显升高(p＜0.05，图1-3-2)；同时，Rb蛋白的表达水平亦明显高于对照组(p＜0.05，图1-3-3)。 3.3利用荧光探针DCHF检测细胞内ROS水平变化的结果表明，用8μg/ml的D609处理细胞6h后，神经元存活被抑制，细胞内的ROS水平显著降低(p＜0.01，图1-3-4)。 4.RNAi阻断神经元中膜整连蛋白β4的表达4.1 利用免疫组织化学染色结合激光扫描共聚焦显微技术，检测了小鼠大脑皮层冰冻切片和原代神经元中膜整连蛋白β4的表达情况。在胚龄14天(E14)，发育中的大脑皮层和神经元均可以检测到明显的膜整连蛋白β4表达阳性(图2-1-1)。 4.2利用罗丹明标记的没有干扰效果的siRNA(rhodamine red-labeled siRNA)转染原代神经元，检测神经元转染效率为30％-50％，说明由siRNA介导的基因沉默实验系统有效可行(图2-1-2)。 4.3用膜整连蛋白β4特异性的siRNA阻断其在神经元的表达，随后用免疫细胞化学法和Western blot法(图2-1-5)检测干扰效果，结果表明，此特异性siRNA能够有效的阻断膜整连蛋白β4的表达，且呈剂量(图2-1-3)和时间(图2-1-4)依赖性。 5.阻断膜整连蛋白β4表达诱导神经元细胞凋亡5.1 MTT法和台盼蓝染色检测结果表明，用20-60nM的膜整连蛋白β4特异性siRNA转染细胞24-72h后，细胞存活率从95.3％显著下调到13.9％，且呈时间和剂量依赖性，对照siRNA对细胞的存活率没有影响(图2-2-1)。 5.2倒置相差显微镜观察和吖啶橙染色结果表明，用膜整连蛋白β4 siRNA转染48小时后，胞体皱缩，出现明显的凋亡形态，折光性减弱，神经突起发生断裂或明显缩短，细胞核固缩、染色质凝集且边缘化、核碎裂，凋亡小体清晰可见(图2-2-2)。 5.3用TUNEL法进一步检测了神经元的凋亡率，用siRNA阻断膜整连蛋白β4表达后，标记的阳性细胞高达85.5％(p＜0.01，图2-2-3)，而转染对照siRNA的细胞仅有6.8％被标记。 5.4通过分析乳酸脱氢酶(LDH)的活性，发现膜整连蛋白β4的siRNA转染细胞48小时后，各组细胞培养液上清中乳酸脱氢酶的活性没有明显差异，说明细胞没有发生坏死(图2-2-4)。 6.膜整连蛋白β4调节神经元存活与凋亡的分子机制6.1 利用荧光探针DCHF检测细胞内ROS水平变化，结果表明，用siRNA特异性阻断神经元中膜整连蛋白β4表达，细胞发生凋亡，同时细胞内的ROS水平比正常组或对照组有明显上升(p＜0.01，图2-3-1)。 6.2 NADPH氧化酶的活性检测结果表明，膜整连蛋白β4表达下调后，细胞内NADPH氧化酶的活性明显升高(p＜0.01，图2-3-3)；SOD的活性检测结果表明，Cu/ZnSOD和MnSOD的活性均没有明显的变化(p＞0.05，图2-3-2)。 6.3在干扰膜整连蛋白β4表达的同时，用NADPH氧化酶的特异性抑制剂(DPI)抑制其活性，神经元的凋亡被有效抑制(p＜0.01，图2-3-4)，同时神经元细胞内活性氧水平的升高被抑制(p＜0.01，图2-3-5)。 结论： 1.在正常生理条件下，PC-PLC是调节神经元存活的关键因子。 2.抑制PC-PLC活性会阻断神经元存活，膜整连蛋白p4和Rb蛋白可能参与PC-PLC介导的神经元存活过程。 3.细胞内活性氧的适中水平对于神经元的存活必不可少。 4.膜整连蛋白β4是调节神经元存活与凋亡的关键因子。 5.NADPH氧化酶产生的活性氧是膜整连蛋白β4调节神经元存活与凋亡的关键因素。 6.膜整连蛋白β4的适当表达对神经元的存活具有重要作用。