薤白多糖的化学修饰、结构分析及生物活性研究

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薤白(Allium macrostemon Bge.)别名紫根蒜、小根蒜,是百合科草本植物。中医常用作胸闷、肺喘等疾病的治疗,其味微苦、辛,性温。薤白耐瘠耐旱,在我国分布广泛,而且药食两用,具有较大的开发价值。薤白有调血脂、抗肿瘤等活性,已经从薤白中分离得到前列腺素、含氮含硫化合物以及挥发油成分等,但少见有关其多糖的报道。本文主要对薤白多糖的水提醇沉法工艺、分离纯化、多糖纯度及分子量测定、多糖结构分析、硫酸酯化修饰、生物活性等方面进行研究。结果如下:(1)采用水提醇沉法提取薤白多糖,其最佳工艺为:按1:14的料液比投料,90℃,提取80min,得薤白粗多糖(cAMP),提取率可达14.26%。并采用蛋白酶与Sevag法相结合去除cAMP中的蛋白质,采用3%的H202溶液,60℃,恒温反应2h进行脱色,结果显示蛋白质去除及脱色效果较好,经透析后得半纯薤白多糖(AMP)。(2)分别用柱层析法和分级醇沉法对AMP进行分离纯化,并用高效凝胶渗透色谱仪(GPC)测定纯度和分子量。其中采用DEAE-32纤维素加Sephadex G-100柱层析法分离得到三种不同分子量的均一多糖AMP-I’(1.50×104Da)、AMP-Ⅱ’(8.95×105Da). AMP-Ⅲ’(1.51×106Da),最终得率分别为7.58%,1.75%,3.42%;采用分级醇沉法分离得到两种均一多糖AMP-Ⅰ(1.57×104Da)和AMP-Ⅲ(1.55×106Da),得率分别为17.31%,7.82%。比较两种方法,确定了采用分级醇沉法纯化薤白多糖,并选用AMP-Ⅰ及AMP进行化学修饰,再结合AMP-Ⅲ进行生物活性研究。通过薄层色谱法及高效液相色谱法分析,结果表明AMP-Ⅰ由葡萄糖、半乳糖组成;AMP-Ⅲ由葡萄糖、果糖及半乳糖组成。AMP-Ⅰ的主链由葡萄糖和半乳糖构成,主链核心由葡萄糖构成,葡萄糖和半乳糖构成支链或主链的末端残基。AMP-Ⅲ的主链由葡萄糖、半乳糖及果糖构成,葡萄糖及半乳糖构成其主链核心,支链或主链的残基末端由葡萄糖及果糖构成。(3)采用氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法及浓硫酸法对AMP和AMP-Ⅰ进行硫酸酯化修饰,得到酯化产物。经过理化性质、紫外及红外光谱分析,显示各酯化多糖均存在硫酸根基团,表明多糖与酯化试剂结合生成了酯。采用BaSO4浊度法进行取代度(DS)测定,结果显示纯化薤白多糖的DS高于对应的半纯薤白多糖的DS。三种修饰方法取代度大小依次为:氯磺酸-吡啶法,三氧化硫-吡啶法,浓硫酸法。通过单因素实验和L9(34)正交试验,研究了酯化试剂比例、反应温度和反应时间对氯磺酸-吡啶法修饰薤白多糖的影响,以DS和得率为指标,得出了其最佳酯化条件为V氯磺酸:V叱咤为1:5,温度为80℃,时间为90min。结果显示,在最佳条件下AMP的DS为].624,得率为81.24%;AMP-Ⅰ的DS为1.735,得率为83.13%。(4)采用邻二氮菲-Fe2+-H202体系研究薤白多糖的羟自由基清除能力。表明薤白多糖及硫酸酯化后的薤白多糖均有清除作用,且清除作用基本都随着浓度的增大而增强。其中以AMP-Ⅲ的清除作用最强,在8mg/mL时达51.32%。未修饰多糖的清除率大小为:AMP-Ⅲ> AMP> AMP-Ⅰ。修饰后的多糖在羟自由基的清除作用上有所减低。(5)采用荧光探针法对多糖与DNA的相互作用进行研究,结果表明,薤白多糖与DNA均有相互作用,不同的薤白多糖具有不同的作用常数,并且在一定范围内存在一个最大值。AMP-Ⅰ和AMP-Ⅲ的最大作用常数与AMP的接近,但是对应的浓度降低较多。粗多糖的最大作用常数很小(仅11.07%,约为AMP的一半)而其相应浓度较高(0.3mg/mL),提示与DNA相互作用的主要活性成分是多糖,而不是蛋白质。经过硫酸酯化修饰后的多糖与DNA的作用均有较大的增强,其中修饰后AMP-Ⅰ的作用常数最大,为38.25%,对应浓度为0.01mg/mL,比原糖增强了两倍多。三种修饰方法所得多糖与DNA作用的次序为:氯磺酸-吡啶法>三氧化硫-吡啶法>浓硫酸法,其中,使用氯磺酸-吡啶法修饰多糖与DNA的作用明显强于其他两种方法。此外,用同一种修饰方法所得均一多糖酯化产物与DNA的作用强度略高于相应的半纯多糖。
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