本研究出发点和目的：针对该课题的研究方向，我们将着眼于介导VEC增殖和凋亡的两条关键信号通路的共同调控作用，寻找它们之间可能存在的关联，以及可能平衡这两条信号通路的共调控关键位点。尽管现在有许多研究证明VEGFR2与TNFR1介导的细胞内信号转导对VEC的增殖和凋亡具有重要的调控作用，然而这两条主要信号通路介导产生的生物信息传递是如何从生理应激状态下的动态平衡转化成病理生理状态下的失平衡，最终导致VEC功能障碍和凋亡的具体机制目前尚未明了。我们从许多血管受累性疾病的发病机制当中看到了它们发病机制中一个重要交汇点。我们希望以糖尿病和深静脉血栓形成等临床常见病作为切入点，探讨VEGFR2与TNFR1介导信号通路共调控VEC增殖与凋亡的作用机制。本课题设计旨在通过体外和体内实验，包括体外培养细胞、构建糖尿病和DVT动物模型来观察研究VEC的病理生理改变，探索其内在的机制，深入分析导致VEGFR2与TNFR1介导的细胞增殖和凋亡信号通路调控失平衡的可能因素。同时希望通过具有抗氧化应激、抗炎作用的原花青素及其低聚物调控VEGFR和TNFR的失平衡来保护VEC。　　 本课题研究内容包括如下三部分：第一部分，高浓度葡萄糖损伤人脐静脉内皮细胞的机制研究;第二部分，结扎糖尿病大鼠肾下段下腔静脉诱导深静脉血栓形成与血管内皮细胞损伤的作用及其机制研究;第三部分，原花青素及其低聚物治疗糖尿病大鼠合并深静脉血栓形成的初步研究。　　 第一部分高浓度葡萄糖损伤人脐静脉内皮细胞的机制研究　　 [目的]探索高浓度葡萄糖损伤VEC的高糖时间和浓度效应，阐述VEGFR和TNFR共调控失衡是糖尿病血管并发症和内皮细胞损伤的重要因素，高糖对VEGFR通路和TNFR通路的调控影响内皮细胞增殖和凋亡的作用。　　 [材料与方法]以原代培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，分别用不同浓度的葡萄糖加入培养基中(5mmol/L，15mmol/L，30mmol/L，60mmol/L)，应用Griess化学发光法检测一氧化氮(NO)；RT-PCR检测内皮性一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达；分子探针检测ROS；western blot检测蛋白eNOS，iNOS，VEGF，TNF-α，VEGFR2，p-AKT，RIP，TRADD，TRAF-2，FAP-1，PTEN和NF-κB；免疫荧光检测NF-κB核内转移介导细胞凋亡；MTT法检测内皮细胞的活性试验；Annexin-v-FITC/PI双标记流式细胞仪检测细胞凋亡。　　 [结果]高糖早期(24h)即升高HUVEC的NO、eNOS、VEGF、VEGFR2、TNF-α、ROS等表达。HUVEC在48h内无明显的细胞活性下降和细胞凋亡发生。然而随着高糖的持续刺激，ROS的产生在72小时升高达到峰值，同时细胞内表达iNOS，PTEN，RIP，TRADD，TRAF-2和NF-κB上调，而与抗细胞凋亡信号相关的因子NO、eNOS、p-AKT的表达明显下调，MTT试验和流式细胞仪结果提示，在72-96h，高糖组的HUVEC开始出现明显的细胞活性下降和细胞凋亡增加。　　 [结论]高糖早期没有引起HUVEC的凋亡和活性下降，然而随着高糖时间的持续，氧化应激产生的氧自由基和细胞毒性物质的积累，使VEGFR2介导的细胞增殖与TNFR1介导的细胞增殖和凋亡信号的平衡失调，最终导致HUVEC的功能障碍和细胞凋亡。　　 第二部分结扎糖尿病大鼠肾下段下腔静脉诱导深静脉血栓形成与血管内皮细胞损伤的作用及其机制研究　　 [目的]探讨糖尿病(DM)合并深静脉血栓形成(DVT)对血管内皮细胞的损伤作用，观察糖尿病合并静脉血栓形成过程中VEC的VEGFR和TNFR共调控通路的失平衡，细胞因子和细胞粘附分子表达异常，以及可能加剧内皮损伤的因素。　　 [材料与方法]以Spraque-Dawley大鼠为研究对象，用STZ诱导建立糖尿病大鼠模型。正常饮食一个月后，按随机原则分成5组(A：空白对照；B：下腔静脉结扎(IVC-ligated)；C：IVC-ligated+/低分子量肝素(LMWH)；D：DM+/IVC-ligated；E：DM+/IVC-ligated+/LMWH)，B～E组大鼠均予以肾下段IVC结扎建立DVT模型。通过测量血栓大小，在电镜下观察内皮细胞形态学变化，应用免疫组化、免疫荧光、western blot，ELISA检测VEGFR2、TNFR1、CD34、vWF、IL-6、TNF-α和ICAM-1的表达。　　 [结果]结扎肾下IVC可导致糖尿病大鼠快速形成深静脉血栓，我们观察到血栓形成早期即可有静脉内皮细胞的脱落和坏死。同时伴随着静脉内皮细胞的VEGFR2，CD34表达下调，TNFR1，vWF表达上调；血清细胞因子IL-6和TNF-α释放增加；血栓的ICAM-1表达上调。　　 [结论]持续高糖损害内皮细胞，内皮功能障碍可能是合并静脉血栓形成和血栓性炎症反应的主要原因之一，血栓形成又进一步加剧血管损伤。　　 第三部分原花青素及其低聚物治疗糖尿病大鼠合并深静脉血栓形成的初步研究　　 [目的]应用原花青素及其低聚物治疗糖尿病大鼠合并深静脉血栓形成。探索原花青素及其低聚物的抗血栓形成作用。　　 [材料与方法]以第二部分的动物模型构建和分组为基础，添加葡萄籽原花青素提取物(GSPE)400mg/Kg/d灌胃治疗组。通过测量血栓大小，在电镜下观察内皮细胞形态学变化，应用免疫组化、免疫荧光、western blot，ELISA检测VEGFR2、CD34、vWF、ADAMTS13、IL-6、TNF-α、P-选择素、VCAM-1和ICAM-1的表达。　　 [结果]GSPE减少血栓形成，保护内皮细胞结构的完整性，上调内皮细胞的VEGFR2、CD34、ADAMTS13表达，下调vWF、IL-6、TNF-α、P-选择素、VCAM-1和ICAM-1的表达。　　 [结论] GSPE具有抗血栓形成的作用。其作用机制可能在于保护内皮细胞，减少血小板激活和凝集，减少白细胞粘附损害静脉内皮细胞，对抗促血栓性炎症介质产生释放。结果提示GSPE的抗血栓形成作用，可能对维持内皮细胞增殖和凋亡信号通路的平衡有重要的调控作用。