背景冠心病是人类发病率和死亡率最高的疾病之一,动脉粥样硬化是其病理基础。高血压、糖尿病、吸烟等已公认为是动脉粥样硬化的危险因子。其中,在血脂异常致动脉粥样硬化方面,大量的流行病学和临床试验对低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白等进行了广泛而深入的研究。残粒脂蛋白(Remnant-like lipoproteins, RLPs)是极低密度脂蛋白和乳糜微粒的脂解产物,其颗粒更小,所含甘油三酯更少,而更加富含胆固醇脂和Apo-E,因此理论上更具有致动脉粥样硬化的特性。人的一天中大部分时间处于餐后状态(>12h),而餐后状态与禁食状态相比,血浆中的RLPs浓度明显升高。有研究认为血浆RLPs-C水平是冠心病的独立预测因子,而不依赖于非脂质危险因子及高密度和低密度脂蛋白胆固醇的水平。进一步研究证实血浆RLPs-C水平与内皮功能失调密切相关。RLPs-C的几个致动脉粥样硬化特性已经被证实(如促进炎症,促进泡沫细胞形成及增加氧化应激等),但RLPs-C与内皮功能失调的相关机制仍未完全明确。已知内皮细胞受损或失功能,是动脉粥样硬化的始动因素。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)可以分化为成熟内皮细胞,是内皮细胞再生和维持内皮细胞层完整性的重要机制。各类致动脉粥样硬化危险因子如ox-LDL可加速内皮祖细胞衰老，十冠心病的预测因子之一。迄今为止,残粒脂蛋白与内皮祖细胞衰老机制的相关研究甚少。有待于进一步对其进行深入系统的研究。氧化假说是动脉粥样硬化的主要机制之一。同氧化型低密度脂蛋白一样,RLPs是否通过氧化机制而加速EPCs衰老?有待于进一步证实。由于DNA双链的半保留复制,染色体的末端的端粒进行性缩短,关键的端粒长度或“脱帽”导致染色体不稳定,从而加速细胞衰老,被称为端粒介导的细胞衰老途径。端粒酶,可以把一个小重复片段"(TTAGGG)n"添加到端粒上,从而可以避免或延缓细胞发生衰老。已证实他汀,血管内皮生长因子,HDL和雌激素可以抑制或延缓内皮祖细胞的衰老,其机制或许是通过激活PI3K/Akt信号通路,降低细胞内外的氧化应激,从而增加端粒酶活性。RLPs是否通过上述端粒酶机制调节内皮祖细胞衰老?有待于进一步对其进行系统深入研究。微小RNA (microRNA, miRNA)可以通过与靶基因mRNA的3’非翻译区互补结合,在转录后水平负调节靶基因的mRNA翻译,使相关基因“沉默”或加速相关蛋白降解而失功能。某些miRNA参与调控细胞增值和衰老,且和细胞内氧化应激水平有关。新近报道,miR-34a过表达可经由抑制SIF-1 (silent information regulator 1)而加速内皮祖细胞衰老。RLPs是否加速内皮祖细胞衰老进而致某些miRNAs变化?是否可以预测RLPs诱导的衰老内皮祖细胞相关miRNAs的有关基因?目前未见相关报道。目的本研究利用RLPs干预人EPCs,通过检测衰老相关指标p-半乳糖苷酶和p16INK4a,证实RLPs是否加速EPCs衰老；应用阿托伐他汀(atorvastatin, Ator)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)预处理细胞后,检测EPCs的FAK、Akt及其磷酸化,明确RLPs是否通过上述反应氧类物质通路加速内皮祖细胞衰老；进一步探讨上述通路与端粒酶途径的关系；并筛选衰老相关miRNAs及预测其编码基因。本实验旨在通过对RLPs加速内皮祖细胞衰老的具体分子机制进行系统深入的研究,为动脉粥样硬化的产生和发展提供理论依据。方法1.建立高脂餐模型,抽取餐后4小时外周血并应用低速离心、免疫亲和层析、透析、超速离心及微孔过滤方法分离出RLPs。2。通过酶学方法、Brawald蛋白浓度及琼脂糖电泳方法鉴定分离的RLPs纯度。3.利用密度梯度离心分离人外周血单个核细胞,并经诱导分化培养成功EPCs,细胞流式鉴定EPCs的纯度。4.应用不同浓度RLPs干预EPCs, western blot方法检测p16INK4a蛋白水平,初步确定最佳干预浓度(RLPs,100μg protein/mL)。将EPCs分为空白对照组、RLPs干预组,阿托伐他汀预处理+RLPs干预组及超氧化物歧化酶预处理+RLPs干预组,应用p-半乳糖苷酶化学染色检测衰老细胞数。5.应用免疫化学方法检测四组细胞中nitrotyrosine生成。6.以不同浓度RLPs干预EPCs, TRAP-ELISA法检测端粒酶活性；再次确定最佳干预浓度(RLPs,100μg protein/mL),将细胞分为以上四组,应用TRAP-ELISA法检测端粒酶活性。7. western blot和免疫共沉淀(IP)方法检测磷酸化hTERT蛋白水平,western blot检测总hTERT、FAK、Akt及其磷酸化水平。8.微阵列(micorarray)分析空白对照组和RLPs(100μg protein/mL)诱导的衰老EPCs细胞组miRNAs表达,应用real time RT-PCR验证上述筛选的miRNAs。9.应用全部人类基因4×44K oligo microarrays芯片测定全部mRNA表达,联合生物信息学软件,共同匹配预测相关miRNAs的靶基因。结果1.通过超速离心、免疫亲和层析、透析等方法,可以成功分离RLPs,并经酶学及琼脂糖电泳分析其纯度较高；通过密度梯度离心及培养分化,可以分离培养纯度较高的EPCs。2. RLPs浓度依赖性的增加细胞内p16INK4a蛋白水平。与对照组比较,RLPs (100μg protein/mL)明显增加β-半乳糖苷酶阳性细胞数(P<0.01),阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)预处理后可显著减少RLPs组的β-半乳糖苷酶阳性细胞数(P<0.01)。3.与对照组比较,RLPs (100μg protein/mL)明显增加细胞内nitrotyrosine生成,阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)预处理后可显著抑制RLPs组EPCs的nitrotyrosine生成。4. RLPs浓度依赖性的抑制端粒酶活性,RLPs (100μg protein/mL)显著抑制端粒酶级联亚单位人端粒酶逆转录酶(hTERT)及其磷酸化蛋白表达,阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)预处理可显著改善RLPs组EPCs的端粒酶活性和hTERT蛋白表达。5.与对照组比较,RLPs (100μg protein/mL)显著抑制FAK、Akt及其磷酸化蛋白表达,同样,阿托伐他汀(1μmol/L)和超氧化物歧化酶(50U/mL)预处理可显著改善RLPs的上述抑制作用。6.与对照组比较,在RLPs(100μg protein/mL)诱导的衰老EPCs中,微阵列分析显示16个miRNAs上调,其中1miR-148b, miR-155和miR-513c显著上调；6个miRNAs下调,其中miR-574-3p显著下调。上述结果经real time RT-PCR量化证实miR-148b,miR-155显著上调和miR-574-3p显著下调。7.经由生物信息学软件及全部mRNA匹配分析后显示,miR-148b和miR-155的7个衰老相关基因被确定(miR-148b:CCKBR, ACVR1, DNMT1,ITGA5,GAP43; miR-155:BACH1, FBXO11)结论1. RLPs可加速内皮祖细胞衰老,与细胞内反应氧类物质生成增加有关；2. RLPs或许通过抑制反应氧类物质通路FAK/PI3K/Akt信号通路,抑制端粒酶活性,从而加速内皮祖细胞衰老；3. RLPs可致内皮祖细胞的某些miRNAs及其相关基因表达发生变化,可推测miRNAs参与调控RLPs诱导的内皮祖细胞衰老。