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目的:巨噬细胞能够高效吞噬烟曲霉孢子,所形成的吞噬体通常要先后与内膜系统及胞内细胞器发生复杂物质交换,才能成熟为具有杀死病原体能力的吞噬溶酶体,对包含烟曲霉的吞噬体成熟过程的研究目前还处于起步阶段。本研究探讨巨噬细胞吞噬烟曲霉分生孢子的杀菌规律、吞噬体成熟过程中细胞活性变化规律、影响细胞活性的因素以及吞噬体成熟的关键时间点,并初步探索包含烟曲霉分生孢子吞噬体的提取方法。
方法:本研究拟从细胞微生物学角度,以鼠巨噬细胞吞噬烟曲霉分生孢子为模型,用扫描电镜观察吞噬过程中细胞表面形态变化;采用Triton破膜法测定被巨噬细胞吞噬的孢子存活规律;采用荧光观察法测定巨噬细胞吞噬量的变化;采用MTT的方法测定吞噬孢子后巨噬细胞的细胞活性的变化;利用免疫荧光标记以及激光共聚焦显微镜等技术,观察巨噬细胞吞噬烟曲霉孢子的吞噬体成熟过程;用蔗糖梯度离心的方法,提取包含烟曲霉孢子的吞噬体;利用紫外诱变的方法,筛选烟曲霉获得烟曲霉白化株。
结果:巨噬细胞吞噬乳胶颗粒比吞噬烟曲霉孢子的速度快,但最终吞噬量相同;被巨噬细胞吞噬的烟曲霉孢子在被吞噬后两小时裂解细胞涂平板培养,存活率明显下降;巨噬细胞吞噬正常的休眠孢子后会导致细胞活性下降,而吞噬白化株烟曲霉孢子后细胞活性没有下降,吞噬乳胶颗粒和菌丝后活性也没有下降;用吞噬体早期标志性蛋白标记吞噬孢子后不同时间的巨噬细胞,
在30/0这个时间点就有明显的环状结构,这种结构一直持续存在,到30/60消失;而用晚期吞噬体标志蛋白标记后,在30/60时才出现环状结构。同时,本研究还探索了一种新的提取包含烟曲霉分生孢子的吞噬体方法。
结论:烟曲霉孢子表面有抑制巨噬细胞吞噬的物质;本研究发现烟曲霉孢子能够抑制巨噬细胞细胞活性,萌发后的菌丝不抑制细胞活性,失去色素的白化株烟曲霉孢子也不抑制细胞活性,说明孢子表面的色素可能是抑制细胞活性的因素;巨噬细胞吞噬烟曲霉孢子1 h后活孢子数量开始下降,到2h有50%的孢子失去活性,6 h后有80%以上的孢子失去活性;包含烟曲霉孢子的吞噬体在30/0融合成为早期吞噬体,30/60时融合成为晚期吞噬体。