家蚕中一个新的膜蛋白BmMP160基因的克隆、表达以及在5龄蚕组织中分布

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在对家蚕蛹期cDNA文库测序中,我们筛选到一条cDNA序列,通过生物信息学分析,推测可能是家蚕-膜蛋白基因。该基因长度为726bp,由3个外显子和2个内含子构成,ORF长483bp,编码160个氨基酸残基,蛋白分子量18.58kD,因此我们将其命名BmMP160(Bombyxmorimembraneprotein160),GenBank登录号为DY231129。将BmMP160与数据库中的蛋白进行比对,发现该蛋白仅与昆虫中的一些假想蛋白具有很高的同源性,而在其他种属中同源性不高。 通过PCR把BmMP160的ORF扩增后插入到载体pET-28a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位点,获得重组表达质粒pET-28a(+)-BmMP160,转化大肠杆菌BL21(DE3),经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。IPTG诱导后裂解菌作SDS-PAGE分析,在22kD处有一浓集特异性蛋白条带,与预期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵体的形式存在,超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤;对包涵体进行溶解和梯度透析复性;采用亲和层析纯化融合蛋白rBmMP160。以该融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备了BmMP160多克隆抗体,经ProteinAHP凝胶柱纯化后,ELISA检测该抗体的效价可达到1:8000。免疫印迹检测显示该抗体对BmMP160有特异性识别能力。免疫印迹检测结果还表明,BmMP160在家蚕五龄幼虫的头部、表皮、肠、丝腺、脂肪体、气门、马氏管和生殖腺中均有表达。亚细胞定位和TIRF结果表明,BmMP160定位于细胞质膜上。
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